金力榮，楊麥青，徐洪波，魏燕妮

（1.昌邑市人民醫(yī)院產(chǎn)科，山東 昌邑 261300；2.昌邑市人民醫(yī)院病理科，山東 昌邑 261300；3.濰坊市人民醫(yī)院病理科，山東 濰坊 261041；4.昌邑市人民醫(yī)院輸血科，山東 昌邑 261300；5.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院健康管理系，山東 濰坊 261041）

輸卵管妊娠（tubal pregnancy）是異位妊娠中最常見的一種，是婦產(chǎn)科最為常見的急腹癥[1]。輸卵管妊娠在早期未破裂時(shí)，診斷難度較大，若不經(jīng)及時(shí)早期的診斷和治療，嚴(yán)重者會(huì)因失血致死[2，3]。現(xiàn)階段診斷異位妊娠的方法是通過一系列彩超和持續(xù)監(jiān)測血清β-hCG 的水平，但這些指標(biāo)都不具有特異性，因此探索新的特異性的標(biāo)記物用以早期、及時(shí)診斷輸卵管妊娠具有重要意義。正常妊娠是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，滋養(yǎng)葉細(xì)胞的受控侵襲、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的平衡以及滋養(yǎng)葉細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的影響都起著重要的作用。TGF-β1 位于人染色體19q13.1-q13.3，是一種多功能細(xì)胞因子，可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞生長、分化，影響細(xì)胞外基質(zhì)的形成，維持免疫功能和免疫穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)胚胎發(fā)育等[4-7]。以往研究表明[8，9]，TGF-β1 參與調(diào)解妊娠過程中母體免疫耐受的過程。TGF-β1 水平的改變參與了妊娠期相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，如自然流產(chǎn)、胎盤植入[10，11]。正常的血供和氧供對于維持正常的妊娠也是必不可少的。VEGF 在促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞耐受低氧水平的過程中意義重大[12-14]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，MMPs 在妊娠過程中可以水解細(xì)胞外基質(zhì)，從而調(diào)節(jié)滋養(yǎng)葉細(xì)胞的浸潤功能[15-17]。本實(shí)驗(yàn)綜合以上研究結(jié)論，通過研究TGF-β1、MMP-9、VEGF 在輸卵管妊娠患者絨毛組織中的表達(dá)水平，及其與臨床指標(biāo)的關(guān)系，以期明確TGF-β1、MMP-9、VEGF 在輸卵管妊娠發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月-2020 年12 月于昌邑市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科就診并經(jīng)過臨床診斷且手術(shù)治療的輸卵管妊娠患者40 例作為觀察組，所有患者術(shù)前未經(jīng)任何治療，臨床和病理資料保存相對完整，另選取同期非意愿妊娠正常早孕自愿行人工流產(chǎn)患者40 例作為對照組。兩組年齡、停經(jīng)天數(shù)、孕次、體質(zhì)指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有研究對象均知情并簽署同意書。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者術(shù)前由2 名婦產(chǎn)科醫(yī)師結(jié)合彩超明確診斷；②均為自然受孕；③個(gè)人資料完整；④血常規(guī)、凝血功能正常；⑤血糖、血壓正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①認(rèn)知、精神功能障礙；②合并遺傳疾?。虎酆喜盒阅[瘤。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 經(jīng)手術(shù)切除的輸卵管妊娠標(biāo)本放入10%的中性福爾馬林固定12 h，經(jīng)人工流產(chǎn)術(shù)后的新鮮絨毛組織用0.9%氯化鈉注射液沖洗去掉過多的血凝塊，然后用10%的中性福爾馬林固定12 h。常規(guī)取材后經(jīng)脫水、透明行HE 染色。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 TGF-β1、MMP-9、VEGF兔抗人單克隆抗體（工作液濃度1∶100）購買于武漢三鷹生物科技有限公司。所有絨毛組織標(biāo)本均經(jīng)2位病理醫(yī)師獨(dú)立診斷。取3～4 μm 切片，免疫組織組織化學(xué)方法采用SP 法，具體步驟包括：烤箱烤片、脫蠟、脫水；檸檬酸修復(fù)，羊血清孵育；滴加一抗（TGF-β1、MMP-9、VEGF）；滴加生物素標(biāo)記的二抗抗體；加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶；滴加DAB 顯色液觀察顯色。染色滴加一抗時(shí)用PBS 液替代一抗當(dāng)做陰性對照。

1.4 結(jié)果判讀 依據(jù)美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)ASCO 分級分別對TGF-β1、MMP-9、VEGF 的染色進(jìn)行判讀。染色陽性的細(xì)胞面積＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，依次記為0、1、2、3、4 分。細(xì)胞著色強(qiáng)度標(biāo)記-、+、++、+++，依次記為0、1、2、3 分。將染色陽性的細(xì)胞面積評分和細(xì)胞著色強(qiáng)度評分相乘，＜4 分為低表達(dá)，≥4 分為高表達(dá)。

1.5 觀察指標(biāo) 比較兩組絨毛組織中TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表達(dá)水平，分析觀察組絨毛組織中TGF-β1、MMP-9、VEGF 表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系，探討TGF-β1與MMP-9、VEGF 的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0 對本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；相關(guān)關(guān)系采用Pearson 相關(guān)性分析；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TGF-β1、MMP-9、VEGF 表達(dá)比較 觀察組TGF-β1、VEGF 蛋白表達(dá)低于對照組，MMP-9蛋白表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組TGF-β1、MMP-9、VEGF 表達(dá)比較[n（%）]

2.2 觀察組TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系 觀察組絨毛組織中TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表達(dá)水平與年齡、停經(jīng)天數(shù)、孕次、體質(zhì)指數(shù)無關(guān)（P＞0.05），見表3。

表3 觀察組TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.3 觀察組TGF-β1 的表達(dá)與MMP-9、VEGF 表達(dá)的關(guān)系 觀察組TGF-β1 的表達(dá)與VEGF 呈正相關(guān)（r=0.326，P＜0.05），與MMP-9 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.353，P＜0.05），見表4、圖1。

圖1 TGF-β1 與VEGF、MMP-9 的相關(guān)性

表4 觀察組TGF-β1 表達(dá)與MMP-9、VEGF 表達(dá)的關(guān)系

3 討論

輸卵管妊娠是最常見的異位妊娠，以壺腹部妊娠最多見[3，18]。輸卵管妊娠未破裂時(shí)，臨床癥狀不典型，較難診斷，若不及時(shí)診斷和早期治療，嚴(yán)重者可危及生命。目前臨床采用輸卵管切除術(shù)和/或保守治療，手術(shù)切除會(huì)影響患者的再次妊娠，保守治療可能會(huì)再次導(dǎo)致輸卵管妊娠[19，20]。各治療效果都存在差異，因此探索新的用于指導(dǎo)診斷和治療的生物標(biāo)志物對于改善患者預(yù)后意義重大。

在胚胎植入過程中，胚囊和子宮內(nèi)膜的同步增殖和發(fā)育是建立妊娠的重要因素。成功的植入過程還需要調(diào)節(jié)母體對胚胎的免疫系統(tǒng)，增加植入部位的血管生成，以及基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化，滋養(yǎng)葉細(xì)胞的受控侵襲等。一些生長因子/細(xì)胞因子及其受體的增加意味著這些因子在植入調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用。這一過程中可能涉及的因素之一是TGF-β[21，22]。TGF-β1是TGF-β 亞型中最具代表性的一種，在對促進(jìn)血管的形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)等有重要作用[9-11]。TGF-β1 在早期自然流產(chǎn)和胎盤植入等妊娠相關(guān)疾病中出現(xiàn)異常表達(dá)[10，11]，說明TGF-β1 在正常妊娠過程中起著一定的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在輸卵管妊娠患者絨毛組織中TGF-β1 的表達(dá)減少，且TGF-β1 的表達(dá)與年齡、停經(jīng)天數(shù)、孕次、體質(zhì)指數(shù)一般臨床指標(biāo)無關(guān)，提示TGF-β1 參與影響輸卵管妊娠的形成。

VEGF 是調(diào)節(jié)血管生成的主要因子之一。VEGF參與調(diào)控多種基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管形成、增加血管通透性[12-14]。VEGF在稽留流產(chǎn)患者血清中表達(dá)降低，在早期妊娠中表達(dá)降低會(huì)影響滋養(yǎng)葉細(xì)胞的侵襲和遷移，從而影響妊娠的正常發(fā)生[23]。有研究指出[24]，VEGF 在輸卵管妊娠患者血清中異常增多，可以用于輸卵管妊娠的診斷。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 在輸卵管妊娠患者絨毛組織中減少，與前述研究結(jié)果不同，可能是實(shí)驗(yàn)方法和選取的實(shí)驗(yàn)對象不同。說明VEGF 表達(dá)異常參與了輸卵管妊娠的發(fā)展過程，同時(shí)，TGF-β1 與VEGF 在輸卵管妊娠絨毛中的表達(dá)呈正相關(guān)，說明TGF-β1的表達(dá)與VEGF 的表達(dá)的變化有關(guān)，TGF-β1 對輸卵管妊娠的影響可能與VEGF 參與的血管形成過程有關(guān)。

MMPs 是鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，其中MMP-9起關(guān)鍵作用，MMP-9 的活化能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，有助于提高妊娠過程中滋養(yǎng)葉細(xì)胞的侵襲功能[15，16]。TGF-β1、MMP-9 的異常表達(dá)與重度子癇的發(fā)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9 在輸卵管妊娠患者絨毛組織中增多，說明滋養(yǎng)葉細(xì)胞的局部侵襲能力增強(qiáng)，并且TGF-β1 在輸卵管妊娠絨毛組織中的表達(dá)與MMP-9 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，TGF-β1 對輸卵管妊娠的影響與MMP-9 有關(guān)，其與MMP-9 的作用是相反的。

綜上所述，TGF-β1 與VEGF 在輸卵管妊娠患者絨毛組織中的表達(dá)減少，而MMP-9 的表達(dá)升高；TGF-β1 的表達(dá)與VEGF 的表達(dá)呈正相關(guān)，與MMP-9 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；絨毛組織中TGF-β1、MMP-9、VEGF 蛋白表達(dá)異?？赡軈⑴c了輸卵管妊娠的發(fā)生。