王光路，劉蘭茜，鄭穎，馬歌麗，張治剛，王永亮，楊雪鵬*

1(鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院,食品生產與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州，450001) 2(賈湖酒業(yè)集團有限責任公司，河南 舞陽，462400)

高溫堆積發(fā)酵是白酒生產過程中的一個重要環(huán)節(jié)，又稱“二次制曲”，堆積發(fā)酵可匯聚空氣中的微生物[1-2]，促進酒醅中的淀粉和蛋白質等物質進行分解轉化，還為美拉德反應提供反應條件及前體物質[3]。高溫堆積發(fā)酵可以較好地改良原酒酒體的風味與品質，改善原酒的風格及豐富原酒的香味物質成分，為形成酒體風格提供香味成分或積累香味前體物質[4]發(fā)揮重要的作用。

張治剛等[5]利用GC法對賈湖白酒的香氣成分進行分析檢測，得出醇類物質是香氣成分中占比最大一類物質,大量文獻表明，白酒中主要醇類物質除乙醇外，還有丙醇、正丁醇、異丁醇等高級醇，且含有芳香族類的β-苯乙醇[6-9]。β-苯乙醇是白酒、黃酒、醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中重要的風味物質，具有柔和、淡雅細膩的玫瑰氣味[10]。β-苯乙醇是白酒形成獨特風味的重要因素之一，同時也與擁有玫瑰香氣的壬酸乙酯的合成有關[6]。由此可見，β-苯乙醇對白酒呈香具有較為重要的影響[5,11]。酵母菌是合成β-苯乙醇主要菌屬，已有釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母等種屬合成β-苯乙醇的研究[12-15]。因此本文嘗試從賈湖酒廠高溫堆積酒醅中分離篩選出高產β-苯乙醇酵母菌株，并對其進行分子生物學鑒定、產香培養(yǎng)條件優(yōu)化以及產香特性的研究[16-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

賈湖高溫堆積酒醅樣品；β-苯乙醇標品、L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)、UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、2×SanTaqPCR Mix，上海生工生物工程有限公司；色譜級甲醇，Giovini Chemical Technology有限公司；磷酸二氫鉀，天津市科密歐化學試劑有限公司；無水葡萄糖、無水硫酸鎂，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

YP20001電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；D-37085 PCR儀，Veriti(德國)；UV-1800PC分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；Tanon-3500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；GR85DA型蒸汽滅菌鍋，濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；SHP-25型恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；ZNC-1500智能型潔凈工作臺，蘇潔醫(yī)療器械(蘇州)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、轉化培養(yǎng)基均參考文獻[18]。其中轉化培養(yǎng)基成分調整為(g/L):酵母提取物10.0、L-Phe 5.0、蛋白胨10.0、磷酸二氫鉀2.0、無水硫酸鎂0.5、葡萄糖25.0。

1.4 試驗方法

1.4.1 酵母菌株的分離和產β-苯乙醇酵母菌株篩選

無菌條件下，取適量高溫堆積酒醅加入到含100 mL 無菌水錐形瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)30 min。取不同稀釋梯度涂布于PDA培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)2 d，觀察菌株形態(tài)。將分離菌株30 ℃、200 r/min培養(yǎng)15 h，以1%接種量接入轉化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至葡萄糖完全耗盡結束發(fā)酵。發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min，取上清液，高效液相色譜法檢測β-苯乙醇含量。

1.4.2 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：選取培養(yǎng)24 h菌株純培養(yǎng)物，對其進行細胞觀察和菌落形態(tài)觀察。

分子生物學鑒定：使用試劑盒提取酵母菌基因組，以基因組DNA為模板進行ITS序列擴增，所用引物為通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應體系、基因測序及序列比對分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建方法均參考文獻[18]。

1.4.3 菌株對苯乙醇、乙醇和NaCl耐受性的檢測

采用平板劃線法考察菌株耐受性。β-苯乙醇添加質量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L；乙醇添加體積分數(shù)為2%、4%、6%、8%、10%；NaCl添加質量分數(shù)為5%、10%、15%、20%、25%。

1.4.4 菌株的最適生長初始pH值和溫度

將菌液按1%的接種量轉接至pH值為1～10的100 mL YPD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，每隔12 h測量吸光值OD600。溫度設置為20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)48 h，同樣每隔12 h測量吸光值OD600。

1.4.5 β-苯乙醇合成優(yōu)化試驗

依次考察碳源種類(麥芽糖、葡萄糖、蔗糖)及質量濃度(20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 g/L)、氮源種類(酵母提取物、蛋白胨)及質量濃度(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L)、L-Phe(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L)對菌株發(fā)酵合成β-苯乙醇的影響。

1.4.6 菌株的產香試驗

將菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基活化15 h，按1%的接種量接種50 mL優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液離心，取上清液[18]，采用同時蒸餾萃取法萃取香氣成分，GC-MS法檢測發(fā)酵液揮發(fā)性成分。

1.4.7 高效液相色譜法測定β-苯乙醇含量

采用0.22 μm水系濾膜過濾發(fā)酵上清液，HPLC測定β-苯乙醇含量。操作參數(shù)：色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為V(甲醇)∶V(水)=1∶1；流速0.3～0.5 mL/min梯度上升；檢測波長260 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL[5,18]。

1.4.8 同時蒸餾萃取法和GC-MS分析條件

發(fā)酵液離心，取5 mL上清液利用同時蒸餾萃取裝置濃縮至1.0 mL，有機濾膜過濾后轉入1.5 mL色譜瓶，待GC-MS上樣。GC-MS條件參數(shù)：毛細管色譜柱DB-FFAP(60 m×250 μm×0.25 μm)；手動進樣，分流比為10∶1，進樣口溫度250 ℃；程序升溫50 ℃，保留2 min，以8 ℃/min 的速率升至120 ℃，保留2 min；再以10 ℃/min升至200 ℃，穩(wěn)定5 min；最后以5 ℃/min升至250 ℃，穩(wěn)定20 min；檢測器溫度250 ℃；載氣為He，流速1 mL/min；電子轟擊電離(electron impact ionization，EI)源，電子能量70 eV；掃描范圍10～500 u；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃[19]。

2 結果與分析

2.1 β-苯乙醇合成酵母篩選

通過梯度稀釋結合平板涂布法[18]從酒醅中分離出8株菌株，經菌落形態(tài)和顯微觀察，8株酵母都具有典型的酵母菌特征，初步判定這些菌株為酵母菌，分別編號為Z01，Z02，Z03，Z04，Z05，Z06，Z07和Z08。將轉接轉化培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，考察其轉化能力，結果如圖1所示。其中，酵母菌株Z08合成β-苯乙醇能力最強，含量達到(2.01±0.043)g/L，因此后續(xù)選用酵母Z08進一步試驗。

圖1 不同酵母菌株發(fā)酵液中β-苯乙醇含量Fig.1 β-phenylethanol concentration in fermentation broth of different yeast strains

2.2 酵母Z08的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

菌株Z08其平板菌落和細胞形態(tài)特征見圖2。由圖2可以看出，菌落呈現(xiàn)乳黃色，表面光滑，黏稠，邊緣整齊(圖2-a)；菌體為長橢圓形，無菌絲體，具有酵母菌株特征(圖2-b)。

a-菌株Z08菌落形態(tài)特征；b-菌株Z08細胞形態(tài)特征圖2 菌株Z08在YPD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征及光學 顯微鏡(10×100倍)下細胞形態(tài)特征Fig.2 Strain Z08 colony morphology characteristics on YPD medium and cell morphology characteristics under optical microscope (10×100 times)

2.2.2 分子生物學鑒定

通過PCR成功擴增出酵母Z08的ITS1～ITS4片段，測序后獲得基因序列，將其于Genebank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，結果表明該菌與庫德里阿茲威(氏)畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)的同源性最高，其相似度達到90%。使用MEGA X構建菌株間系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結果表明酵母Z08與庫德里阿茲威(氏)畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)的親緣關系最近。根據(jù)分子生物學鑒定菌株Z08屬于庫德里阿茲威(氏)畢赤酵母。

圖3 基于ITS基因序列的Z08菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Z08 strain based on ITS gene sequence

2.3 菌株耐受性測定

按照方法1.4.3分別考察菌株Z08對β-苯乙醇、乙醇、NaCl的耐受特性，結果如表1所示，當β-苯乙醇質量濃度為4.0 g/L時，該菌生長受到抑制；當質量濃度達到6.0 g/L時，菌株完全不能生長。該菌對乙醇最大耐受體積分數(shù)為10%，屬于乙醇高耐受性菌株；而其對NaCl的最大耐受質量分數(shù)高達5%，也具有一定的耐高滲能力。

表1 酵母菌株Z08耐受性試驗結果Table 1 Yeast strain Z08 tolerance test results

2.4 最適生長pH值和溫度

按照方法1.4.4分別考察菌株的最適生長pH和最適生長溫度。如圖4-a所示，酵母Z08在pH 1～10均能生長，pH適應范圍廣，具有一定酸堿耐受能力。該菌最適生長pH為6～8，比一般酵母最適生長pH 4.0～5.5高。從圖4-b可以看出，酵母Z08最適生長溫度為30 ℃，與大多數(shù)酵母生長最適生長溫度相一致。

a-酵母菌株Z08的最適生長pH；b-酵母菌株Z08的最適生長溫度圖4 酵母菌株Z08的最適生長pH和溫度Fig.4 Optimal growth pH and temperature of yeast strain Z08

2.5 酵母Z08優(yōu)化合成β-苯乙醇

2.5.1 碳源種類對生物轉化β-苯乙醇的影響

按照方法1.4.5考察碳源對β-苯乙醇合成的影響。根據(jù)酵母菌同化碳源試驗文獻，選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為碳源，質量濃度均為50.0 g/L，L-Phe添加量為6.0 g/L，其余成分均與轉化培養(yǎng)基相同，發(fā)酵結果如表2所示，Z08基本無法利用蔗糖和麥芽糖生產β-苯乙醇，但可以利用葡萄糖高效合成β-苯乙醇。

表2 不同碳源對轉化合成β-苯乙醇的影響Table 2 The influence of different carbon sources on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

在上述結果基礎上，在轉化培養(yǎng)基中添加20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 g/L的葡萄糖，考察不同葡萄糖濃度對β-苯乙醇合成水平的影響，結果如圖5所示。葡萄糖質量濃度為20.0～60.0 g/L時，隨著葡萄糖濃度的增加，β-苯乙醇產量也在增加。當葡萄糖質量濃度為60 g/L時β-苯乙醇產量達到最高值(2.78±0.049)g/L，而當葡萄糖質量濃度增加到80.0、100.0 g/L時，β-苯乙醇產量大幅下降。

圖5 不同濃度葡萄糖對轉化合成β-苯乙醇的影響Fig.5 The effect of different concentrations of glucose on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

2.5.2 氮源對生物轉化β-苯乙醇的影響

按照方法1.4.5考察碳源對β-苯乙醇合成的影響。根據(jù)酵母菌文獻報道，選擇酵母提取物和蛋白胨，質量濃度為10 g/L，在培養(yǎng)基中添加6.0 g/LL-Phe，發(fā)酵結果如表3所示，酵母提取物作為氮源時，β-苯乙醇產量比蛋白胨高1.53倍。

表3 不同氮源對轉化合成β-苯乙醇的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

在上述結果基礎上，于轉化培養(yǎng)基中添加3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L酵母提取物，考察不同酵母提取物濃度對β-苯乙醇合成水平的影響，結果如圖6所示。酵母提取物在0～7.0 g/L時，β-苯乙醇產量增加較明顯，當酵母提取物質量濃度超過7.0 g/L后，β-苯乙醇產量雖然在增加，但幅度不大。

圖6 酵母提取物濃度對β-苯乙醇轉化合成的影響Fig.6 Effect of yeast extract concentration on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

2.5.3L-Phe對生物轉化β-苯乙醇的影響

酵母合成β-苯乙醇主要是通過艾氏途徑，消耗底物L-Phe，將其轉化為β-苯乙醇。按照方法1.4.5考察不同L-Phe濃度對β-苯乙醇合成的影響，結果如圖7所示。在L-Phe質量濃度為0～4.0 g/L時，隨著底物的增加，β-苯乙醇合成水平不斷增加，當?shù)孜镔|量濃度超過4.0 g/L后，β-苯乙醇合成水平開始下降。

圖7 不同濃度L-Phe對轉化合成β-苯乙醇的影響Fig.7 The effect of different concentrations of L-Phe on the conversion and synthesis of β-phenylethanol

2.5.4 培養(yǎng)基主要成分的正交試驗

通過單因素優(yōu)化試驗初步確定酵母菌Z08合成β-苯乙醇主要影響因子為酵母抽提物、葡萄糖、L-Phe和pH，磷酸二氫鉀和無水硫酸鎂由于單因素試驗不能綜合反應各因素、水平間的交互作用，因此在單因素試驗結果的基礎上，即2.0 g/L的磷酸二氫鉀和0.5 g/L的無水硫酸鎂的條件下，采用正交試驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，實驗設計見表4。

正交試驗結果表明，最佳轉化培養(yǎng)基成分為葡萄糖50.0 g/L，酵母提取物12.0 g/L，L-Phe 5.0 g/L，pH 6.0，可見酵母提取物對酵母細胞Z08合成β-苯乙醇有顯著影響。

2.5.5 不同發(fā)酵時間對β-苯乙醇產量的影響

由于β-苯乙醇具有一定的揮發(fā)性，因此合適的發(fā)酵時間對β-苯乙醇合成也有一定影響。在上文確定最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，測定不同發(fā)酵時間β-苯乙醇含量，結果如圖8所示。發(fā)酵38 h時達到最高產量(3.74±0.084)g/L，隨后產量逐漸下降，并且菌體密度不斷降低，因此確定38 h為最佳發(fā)酵時間。

表4 正交試驗設計與結果分析Table 4 Result analysis and design of orthogonal experiment

2.6 酵母Z08發(fā)酵產香特性

將菌株酵母Z08接種于優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液取10 mL，離心除去菌體，取上清液與二氯甲烷等體積混合后進行蒸餾收集餾分。采用GC-MS對餾分進行揮發(fā)性香味成分進行分析，各成分含量檢測結果如表5所示，在發(fā)酵產物揮發(fā)性成分中，醇類化合物相對含量最高，達到了55.38%，其中苯乙醇相對含量達到了55.32%。其次是芳香族化合物，相對含量為16.17%，以2,4-二甲基苯并[H]喹啉為主，其相對含量為4.42%。酯類化合物相對含量為14.35%，以乙酸苯乙酯為主，其相對含量為8.91%。酮類化合物相對含量為10.71%，其中以2-乙基吖啶為主，相對含量為5.47%。酸類物質相對含量為0.78%，醛類物質相對含量為0.16%，還有一些其他的烷烴類和雜環(huán)類和未測定出的化合物，總相對含量為2.45%。

圖8 不同發(fā)酵時間對β-苯乙醇產量的影響Fig.8 The effect of different conversion times on the yield of β-phenylethanol

表5 酵母Z08發(fā)酵液中揮發(fā)性成分檢測結果Table 5 Test results of volatile components in yeast Z08 fermentation broth

3 討論

目前國內外發(fā)酵生產β-苯乙醇菌種以酵母菌為主，如產朊假絲酵母(Candidautilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和克魯維酵母(Kluyveromycessinensis)等[20]。本文針對賈湖堆積酒醅中的酵母進行分離、篩選，從中獲得1株產β-苯乙醇的酵母菌株。通過對其進行形態(tài)和分子生物學鑒定，發(fā)現(xiàn)該酵母Z08為庫德里阿茲威(氏)畢赤酵母。庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriarzerii)存在于各種天然發(fā)酵、果實和土壤中，能夠較好地適應各種環(huán)境壓力，如低氧、低pH值、高溫、高乙醇濃度等等。在傳統(tǒng)食品和飲料的發(fā)酵過程中容易分離得到，如白酒、可可豆發(fā)酵、葡萄酒、發(fā)酵乳等。通過考察Z08對β-苯乙醇、乙醇、NaCl的耐受性，發(fā)現(xiàn)其具有較好的乙醇和耐高滲特性。同時驗證了該菌在不同溫度和pH條件下生長情況，確定該菌株具有較寬泛pH生長范圍。通過單因素和正交試驗最終確定了該菌株最適發(fā)酵條件為葡萄糖50 g/L、酵母提取物12.0 g/L、L-Phe 5.0 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L和無水硫酸鎂0.5 g/L。在溫度30 ℃，pH 6.0，200 r/min條件下發(fā)酵38 h后，β-苯乙醇產量最終達到(3.74±0.084)g/L，比優(yōu)化前大幅提升。產香試驗結果表明，苯乙醇、芳香族化合物、乙酸苯乙酯等香味物質含量較高。在產香成分中，苯乙醇、乙酸苯乙酯、2-苯乙基-環(huán)己烷-1,3-二酮等多種風味物質對白酒品質有重要貢獻，說明該菌株產香特性有利于其在白酒釀造中的進一步應用，對提升白酒品質有重要意義。此外，庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriarzerii)還具有作為益生菌和生物控制劑的潛力，同時該菌也在生物乙醇、甘油和琥珀酸生產等方面發(fā)揮重要作用[21]。