施吉翔,翟 東,朱 敏,朱鈺方

(1.上海理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200093;2.中國(guó)科學(xué)院 上海硅酸鹽研究所,上海 200050)

盡管骨組織工程支架在過去幾十年已取得了巨大的進(jìn)步,但是很多支架材料仍無(wú)法滿足臨床要求。一方面,骨修復(fù)支架在植入缺損處后出現(xiàn)的炎癥與氧化應(yīng)激有關(guān),而過氧化氫(H2O2)濃度過高是引起氧化應(yīng)激的主要原因之一。另一方面,骨缺損處因供血不足而導(dǎo)致的供氧不足,嚴(yán)重影響了細(xì)胞生理活動(dòng)、新血管形成和組織的生長(zhǎng)[1-3]。而充足的氧氣對(duì)改善細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和分化至關(guān)重要[3]。在缺氧條件下,細(xì)胞會(huì)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。目前,無(wú)機(jī)過氧化物因能與水(H2O)反應(yīng)生成氧氣(O2)而作為釋氧生物材料被用于氧氣輸送的研究,如過氧化鈣、過碳酸鈉和過氧化鎂等[1]。Touri 等[5]在雙相磷酸鈣支架外包覆不同濃度的過氧化鈣涂層,研究發(fā)現(xiàn)3%過氧化鈣涂層支架在低氧條件下能提高骨細(xì)胞的生存和增殖能力。Lü 等[6]通過實(shí)驗(yàn)證明了混合20%過氧化鈣的角蛋白/絲素蛋白支架能夠在體外兩周內(nèi)穩(wěn)定釋放高水平氧,同時(shí)還具有抗菌功能。然而,過氧化鈣在與水反應(yīng)生成氧氣的同時(shí)還產(chǎn)生了有毒的羥基自由基(·OH)而引起氧化應(yīng)激[7]。因此,有必要尋找既有H2O2清除能力又有釋放氧氣功能且無(wú)毒副作用的生物材料用于骨修復(fù)材料復(fù)合。

通常,H2O2濃度過高是導(dǎo)致病灶部位炎癥的主要因素之一。二氧化錳(MnO2)是一種優(yōu)良的催化劑,可以催化分解H2O2產(chǎn)生氧氣。將MnO2引入炎癥部位可以清除過量H2O2并產(chǎn)生O2,有效改善炎癥環(huán)境。目前已有研究表明,含有MnO2的納米顆粒在癌癥治療、骨關(guān)節(jié)炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的治療方面展現(xiàn)出較大潛力[8-11]。因此,將MnO2引入骨修復(fù)支架,不僅可以通過催化分解骨缺損處過量H2O2而改善炎癥狀況,而且產(chǎn)生的氧氣可以緩解骨缺損處供氧不足,從而提高細(xì)胞活力并促進(jìn)骨修復(fù)。

生物活性玻璃(BG)具有良好的生物活性、優(yōu)異的生物相容性、可降解性等特點(diǎn)[12-13]。與生物惰性材料不同,BG 植入物能與生物組織發(fā)生反應(yīng),在材料表面形成生物活性羥基磷灰石層,使骨骼組織與植入物間形成牢固的結(jié)合界面[14-15]。3D 打印技術(shù)具有精確控制結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì),近年來在骨組織工程支架制備領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[16-17]。尤其是直接墨水書寫打印,作為一種成熟的3D 打印技術(shù),具有加工靈活、效率高、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。Wu等[20]將介孔生物活性玻璃(MBG)和黏結(jié)劑聚乙烯醇(PVA)通過擠出式3D 打印構(gòu)建骨組織工程支架,具有高度可控的孔結(jié)構(gòu)。Li 等[21]通過3D 打印并燒結(jié)得到的80SiO2-15CaO-5P2O5生物玻璃支架達(dá)到人骨小梁的平均抗壓強(qiáng)度(2～12 MPa),生物相容性良好,能促進(jìn)骨細(xì)胞增殖與分化。因此,利用3D 打印技術(shù)制備 BG 支架并表面沉積 MnO2得到的BG-MnO2(BGM)復(fù)合支架,不僅具有可控的多孔結(jié)構(gòu)和良好的生物活性,而且有望催化分解骨缺損處的H2O2而產(chǎn)生O2,有利于骨缺損修復(fù)。

已有研究報(bào)道在材料表面沉積MnO2的方法有水熱法[22-23]、共沉積法[24]、自生成法[25-26]、氧化還原法[27-29]等。其中,氧化還原法操作簡(jiǎn)單,所使用的還原劑種類繁多且經(jīng)濟(jì)、高效(如PAH、MES、油酸等)、且沉積可控。Chen 等[30]采用氧化還原法在α-NaYbF4: Tm@CaF2納米顆粒溶液中添加MES 緩沖液和KMnO4溶液,在α-NaYbF4: Tm@CaF2顆粒表面均勻生長(zhǎng)MnO2納米片,制備成復(fù)合納米顆粒并成功用于生物成像和生物檢測(cè)。Wang 等[31]在PtCo 納米粒子溶液中添加 MES 緩沖液,溶液能夠制備具有高催化活性的單分散球形MnO2@PtCo 花狀結(jié)構(gòu),其在正常和缺氧環(huán)境中對(duì)正常NIH 3T3 細(xì)胞幾乎沒有細(xì)胞毒性。因此,氧化還原法有望實(shí)現(xiàn)MnO2在BG 支架表面的可控沉積而制備得到BGM復(fù)合支架。

基于上述研究進(jìn)展,本研究提出在3D 打印的BG支架表面,采用簡(jiǎn)單的氧化還原法可控沉積MnO2制備BGM 復(fù)合支架,研究了MnO2含量對(duì)BGM 支架結(jié)構(gòu)、理化性能以及催化分解H2O2生成O2的影響,初步探究了BGM 支架的體外生物學(xué)性能。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正硅酸四乙酯(TEOS,98%)、磷酸三乙酯(TEP,99.8%)、四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O,99%)、濃鹽酸(HCl,37%)、嗎啉乙磺酸(MES)、高錳酸鉀(KMnO4)、過氧化氫(H2O2,30%)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。聚乙烯醇(PVA,分子量 : 146000～186000,＞99%)購(gòu)于Sigma-Aldrich。

1.2 BGM 支架的制備

采用溶膠-凝膠方法[32]制備用于3D 打印BG 支架的BG 粉體,配制打印漿料前,用行星球磨機(jī)球磨BG 粉體8 h,然后經(jīng)400 目(38 μm)篩子過篩后備用。3D 打印BG 支架的粘結(jié)劑為10% PVA 溶液,即將PVA (5 g)加入去離子水(45 g)后加熱至95 ℃并持續(xù)攪拌6 h 得到。BG 支架制備過程如下: 首先將10% PVA 溶液與BG 粉末以1 : 1 的重量比進(jìn)行充分混合,形成均勻的糊狀漿料;接著將漿料轉(zhuǎn)移到打印料倉(cāng)中并固定在3-D BioplotterTM(EnvisionTEC GmbH,Germany)打印機(jī)上;然后打印機(jī)通過導(dǎo)入的模型控制打印頭擠出一排排桿狀纖維并組成柵格狀的φ=10 mm 圓形二維平面,相鄰平面的纖維以60°夾角排列,層層堆疊形成3D 多孔素坯支架,其中注射泵的氣體壓力為250～350 kPa,打印速度為4～6 mm/s,針頭尺寸為400 μm;最后干燥的素坯支架在管式爐中升溫至300 ℃ (1 ℃/min)并保溫2 h,再將溫度升高至1050 ℃ (3 ℃/min)并保溫3 h 得到BG 支架。

BGM 支架的制備: 據(jù)文獻(xiàn)[33-34]方法用去離子水配制pH 6的MES緩沖溶液(4-Morpholineethanesulfonic acid hydrate,0.1 mol/L)和KMnO4溶液(0.01 mol/L)。將BG 支架放入MES 緩沖液超聲10 min,支架質(zhì)量與MES 體積比例為25 mg : 1 mL;然后每10 mL MES 溶液中分別加入1、5、9 mL 的KMnO4溶液,繼續(xù)超聲30 min;最后取出支架用去離子水沖洗三次,60 ℃烘箱中干燥24 h,得到BGM 支架。依據(jù)添加的KMnO4量依次命名為BGM1、BGM5 和BGM9支架。

1.3 BGM 支架的理化性能表征

采用場(chǎng)發(fā)射電子掃描顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM,FEI Quanta 450,America)觀察BGM 支架的表面形貌與微結(jié)構(gòu),同時(shí)采用能譜儀(Energy disperse spectroscopy,EDS)分析BGM 支架的表面元素組成及含量。將支架研磨成粉末后用X 射線粉末衍射儀(XRD,Bruker D8 Advance,America)測(cè)定其廣角X射線衍射圖譜,2θ掃描范圍為10°～80°,掃描速率為7 (°)/min。

以去離子水為介質(zhì),采用阿基米德原理測(cè)定支架的孔隙率。孔隙率(P)根據(jù)以下公式計(jì)算:

P=(Wsat-Wdry)/(Wsat-Wsus)×100%,

其中,Wdry是支架的干重,Wsus是支架懸浮在水中的重量,Wsat是支架浸沒在去離子水中的重量。

通過萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(2.5 kN,Zwick-Roell,Germany)以5 mm/min 的位移速度測(cè)定支架的抗壓強(qiáng)度。每組BGM 支架的平行樣本為3 個(gè)。

支架體外礦化: 將支架與模擬體液(Simulated body fluid,SBF)以200 mL/g 的比例靜置于離心管中,到預(yù)定時(shí)間后輕輕取出支架,用去離子水清洗表面后烘干備用。將支架用研缽研碎,取少量粉末與KBr 粉末混合壓片,采用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR,PerkinElmer SPECTRUM 100,Germany)測(cè)定礦化前后支架的FT-IR 譜圖,譜圖掃描范圍為2000～450 cm-1。

支架體外降解性能: 將支架浸泡在37 ℃的Tris-HCl 緩沖溶液中,經(jīng)過1、2、3、5、7、14、21、28 d 后,取出、洗滌、烘干后稱量支架的剩余重量,其中Tris-HCl緩沖液體積與支架質(zhì)量的比例為200 mL/g,并且在每次稱重后重新加入相應(yīng)比例的Tris-HCl 緩沖液。另外,將支架置于37 ℃的新鮮SBF 中測(cè)試支架所在溶液持續(xù)14 d 的pH 變化,其中SBF 體積與支架質(zhì)量的比例為200 mL/g。

1.4 BGM 支架催化過氧化氫產(chǎn)生氧氣

通過便攜式溶解氧測(cè)定儀(JPB-607A)測(cè)試溶液的飽和氧濃度。為了測(cè)定BGM 支架對(duì)H2O2的催化產(chǎn)氧能力,首先將測(cè)試氧電極探針插入配制的H2O2溶液中以實(shí)時(shí)記錄溶液的氧濃度。待數(shù)值穩(wěn)定后,將支架放入待測(cè)濃度的H2O2溶液中,通過測(cè)定儀上的數(shù)值實(shí)時(shí)記錄溶解氧濃度隨時(shí)間變化的情況。分別測(cè)試BGM 支架在不同濃度H2O2溶液中的飽和氧濃度變化。每組測(cè)試進(jìn)行三組平行試驗(yàn),其中H2O2溶液與支架的比例為200 mL/g。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

采用兔源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞采用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng),其中DMEM 培養(yǎng)基含有10%牛胎血清(FBS),4.5 g/L 的葡萄糖(Gibco,Carlsbad,CA)和抗生素(青霉素,100 U/mL;鏈霉素,0.1 mg/mL)。將滅菌鍋滅菌(121 ℃,30 min)的BG 和BGM 支架置于24 孔板內(nèi),然后向每個(gè)支架滴加200 μL 含1×105rBMSCs 的細(xì)胞懸液,30 min 后加入培養(yǎng)基沒過支架,并在37 ℃、5% CO2的氣氛培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

通過 CCK-8(Cell counting Kit-8) 方法評(píng)估rBMSCs 在支架上的增殖情況。各組支架接種rBMSCs后分別培養(yǎng)1、3 和7 d,向各孔中加入360 μL 的培養(yǎng)基和40 μL 的CCK-8 溶液,繼續(xù)在37 ℃、5% CO2氣氛培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。然后在每個(gè)孔中取出100 μL溶液轉(zhuǎn)移到新的96 孔板中,并使用酶標(biāo)儀(BioRad 680,USA)測(cè)試450 nm 處的OD 值,用以定量表征細(xì)胞增殖情況。

通過測(cè)試堿性磷酸酶活性(Alkaline Phosphatase,ALP)的表達(dá)來分析各組支架上的細(xì)胞初期成骨分化狀況。將接種rBMSCs 的支架培養(yǎng)3 和7 d 后,使用PBS 和Tris-HCl 緩沖液清洗三次。接著,使用200 μL的0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶液溶解細(xì)胞,超聲分散后在4 ℃下14000 r/min 離心。然后,取50 μL 上層清液與150 μL 標(biāo)準(zhǔn)試劑混合,在酶標(biāo)儀405 nm 處讀取OD 值。同時(shí),按檢測(cè)試劑盒說明,作蛋白定量檢測(cè),最后堿性磷酸酶活性以O(shè)D (min·(mg protein)-1)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 BGM 支架結(jié)構(gòu)表征

圖1(A)為BG 和BGM 支架的光學(xué)照片。由圖可見,BG 支架為白色,而隨著制備過程中KMnO4的添加量增加,BGM 支架表面顏色呈現(xiàn)由淺黃色到深棕色的變化,且表面顏色較為均勻。這說明通過改變制備過程中KMnO4的加入量,可以調(diào)控BGM支架表面沉積MnO2的量。圖1(B)為BG 和BGM 支架的廣角XRD 圖譜。根據(jù)圖譜可知,經(jīng)燒結(jié)的BG支架只在2θ=20°～30°存在寬化的饅頭峰,并且沒有其他明顯的衍射峰。而BGM1、BGM5、BGM9 支架在2θ=18.06°處存在衍射峰,對(duì)應(yīng)MnO2的特征峰(PDF-#72-1982)。另外,隨著支架表面MnO2含量的增加,2θ=18.06°處衍射峰變得更為明顯,而 2θ=20°～30°處的饅頭峰有所下降。由此表明BG 支架表面成功沉積了不同含量的MnO2。

圖1 (A)BG 和BGM 支架的光學(xué)照片及(B)XRD 圖譜Fig.1 (A) Optical picture and (B) XRD patterns of BG and BGM scaffolds

圖2為BG 和BGM 支架的SEM 照片及相應(yīng)的表面EDS 譜圖。由圖可以看出,BG 支架在沉積MnO2前后的宏觀結(jié)構(gòu)沒有變化,都呈現(xiàn)有序排列且三維連通的多孔結(jié)構(gòu),表明氧化還原法沉積MnO2不會(huì)破壞支架的宏觀結(jié)構(gòu)。另一方面,隨著沉積過程中KMnO4的添加量增加,支架表面沉積的細(xì)小MnO2顆粒從無(wú)到有,且逐漸增加。由EDS 能譜分析可知,BG 支架表面沒有Mn 元素,而BGM 支架表面則探測(cè)到明顯的Mn 元素;BGM1、BGM5 和BGM9 支架表面的Mn 元素在支架表面的重量占比分別為0.41%、0.94%和1.18%。以上結(jié)果也表明通過氧化還原法可成功將MnO2沉積在BG 支架表面,并且可以通過沉積過程中KMnO4含量控制而調(diào)控MnO2的沉積量。

圖2 BG 和BGM 支架的(A1,A2,B1,B2,C1,C2,D1,D2) SEM 照片和相應(yīng)的(A3,B3,C3,D3)EDS 圖譜Fig.2 (A1,A2,B1,B2,C1,C2,D1,D2) SEM images and corresponding (A3,B3,C3,D3) EDS spectra of BG and BGM scaffolds(A1,A2,A3) BG scaffold;(B1,B2,B3) BGM1 scaffold;(C1,C2,C3) BGM5 scaffold;(D1,D2,D3) BGM9 scaffold

2.2 BGM 支架的孔隙率和機(jī)械強(qiáng)度

通過阿基米德方法測(cè)試計(jì)算得到的BG 和BGM支架的孔隙率如圖3(A)所示。BG、BGM1、BGM5和 BGM9 支架的孔隙率分別為(78.28±0.38)%、(76.81±1.15)%、(78.12±0.67)%和(77.53±0.97)%。各組支架之間的孔隙率沒有明顯的差異,說明BG 支架表面沉積的MnO2顆粒沒有對(duì)支架的連通性和大孔結(jié)構(gòu)造成影響。

BG 和BGM 支架的抗壓強(qiáng)度如圖3(B)所示。可以看出,隨著支架表面沉積MnO2含量的增加,支架的抗壓強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)。BG、BGM1、BGM5和BGM9支架的抗壓強(qiáng)度分別為(2.21±0.15)、(2.61±0.32)、(3.09±0.13)和(3.45±0.39) MPa。從力學(xué)強(qiáng)度考慮,BGM 支架均在2 MPa 以上,滿足人體松質(zhì)骨的最低抗壓強(qiáng)度要求[35]。這里BGM 支架可能因MnO2細(xì)小顆粒能夠沉積在支架表面的細(xì)小孔隙中而改善支架的抗壓強(qiáng)度。Azizi 等[36]研究發(fā)現(xiàn)沉積MnO2的羥基磷灰石復(fù)合支架也同樣獲得了比純羥基磷灰石支架更高的抗壓強(qiáng)度

圖3 BG 和BGM 支架的(A)孔隙率和(B)抗壓強(qiáng)度Fig.3 (A) Porosities and (B) compressive strengths of BG and BGM scaffolds (* p＜ 0.05,** p＜ 0.01)

2.3 BGM 支架的礦化、降解及pH 變化

圖4(A)是BG 和BGM 支架浸泡SBF 前的FT-IR譜圖。由圖可知,在1104、801 和472 cm-1處出現(xiàn)Si-O官能團(tuán)引起的振動(dòng)峰,并且在960、604 和575 cm-1處出現(xiàn)了典型PO43-官能團(tuán)引起的特征振動(dòng)峰[21]。圖4(B)是BG 和BGM 支架在SBF 中浸泡5 d 后的FT-IR 譜圖。相較于浸泡SBF 前的BG 和BGM 支架,各組支架在SBF 浸泡5 d 后的特征振動(dòng)峰均有所增強(qiáng),而且其振動(dòng)峰的增強(qiáng)隨支架表面MnO2含量的增加而更加顯著,說明MnO2沉積有利于支架表面的磷酸鹽物質(zhì)生成。這可能是因?yàn)橹Ъ鼙砻娉练e的MnO2顆?？梢猿蔀榱u基磷灰石成核位點(diǎn),有利于羥基磷灰石生成。因此,BGM支架具有生物活性。

圖4 BG 和BGM 支架(A)浸泡SBF 前和(B)浸泡SBF 5 d 后的FT-IR 譜圖Fig.4 FT-IR spectra of BG and BGM scaffolds (A) before and (B) after soaking in SBF for 5 d

圖5(A)是BG 和BGM 支架在Tris-HCl 溶液中浸泡28 d 的降解曲線。由圖可知,各組支架的降解速率接近,經(jīng)過Tris-HCl 溶液浸泡28 d,各組支架質(zhì)量都約減15%。這說明BGM 支架表面的MnO2對(duì)支架降解的影響較小。圖5(B)為BG 和BGM 支架在SBF 中浸泡14 d 的pH 變化曲線。由圖可見,前三天各組支架浸泡后的溶液pH 呈上升趨勢(shì),之后其pH 變化不大。這可能是由于前期支架中的Ca、P、Si 離子釋放使溶液pH 有一定程度上升,而之后支架表面沉積羥基磷灰石使得溶液中離子交換變緩,pH 變得相對(duì)穩(wěn)定。另一方面,浸泡BG、BGM1、BGM5 和BGM9 支架的SBF 在第三天的pH 分別為(7.54±0.01)、(7.53±0.02)、(7.55±0.02)和(7.56±0.02),說明MnO2作為一種兩性氧化物對(duì)支架在SBF 中的pH 影響不大。當(dāng)支架周圍環(huán)境的pH 與人體體液接近或呈弱堿性時(shí),有利于新生骨生長(zhǎng),并且穩(wěn)定的pH 環(huán)境也是成骨細(xì)胞黏附增殖的關(guān)鍵。

圖5 (A)BG 和BGM 支架在Tris-HCl 中浸泡28 d 的降解曲線及(B)BG 和BGM 支架在SBF 中浸泡14 d 的pH 變化曲線Fig.5 (A) Degradation curves of BG and BGM scaffolds in Tris-HCl for 28 d,and (B) pH change curves of SBF after BG and BGM scaffolds soaking for 14 d

2.4 BGM 支架催化H2O2 產(chǎn)生氧氣

MnO2通過催化分解H2O2可以在溶液中產(chǎn)生一定濃度的飽和氧。圖6(A)是BGM9 支架在不同濃度H2O2溶液中產(chǎn)生的飽和氧濃度曲線,從圖中可以看出,隨著H2O2濃度增加,溶液中的飽和氧濃度逐漸升高,在20 mmol/L 的H2O2溶液中,BGM9 支架使其飽和氧濃度最高時(shí)達(dá)到平均 25.37 mg/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不含H2O2的去離子水溶液中所測(cè)得的飽和氧濃度6.53 mg/L。Hsieh等[37]研究發(fā)現(xiàn)PLGA/CaO2/MnO2復(fù)合納米顆粒能夠使溶液中的飽和氧濃度達(dá)到10～12 mg/L,并且有效緩解低氧張力下細(xì)胞生長(zhǎng)的缺氧狀態(tài),促進(jìn)其成骨分化。一般情況下人體內(nèi)的H2O2濃度在1～8 μmol/L,而巨噬細(xì)胞活化后可產(chǎn)生局部高濃度的H2O2(0.01～1 mmol/L)[38-39]。此外,在炎癥性疾病中的H2O2濃度可能達(dá)到20 mmol/L,這取決于炎癥環(huán)境中的中性粒細(xì)胞[40]。許多H2O2響應(yīng)材料在H2O2濃度為0.02～5 mmol/L 的模擬炎癥環(huán)境中進(jìn)行相關(guān)測(cè)試[41-43]。本研究中BGM9 支架能夠使含H2O2的模擬炎癥環(huán)境(2 mmol/L) 中的飽和氧濃度達(dá)到(11.00±0.36) mg/L,這有緩解細(xì)胞缺氧環(huán)境的效果,有利于細(xì)胞的增殖與分化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)BGM 支架在H2O2(2 mmol/L)溶液中的重復(fù)循環(huán)催化釋放氧氣能力進(jìn)行了評(píng)估。圖6(B)是BGM 支架在含有H2O2(2 mmol/L)溶液中重復(fù)循環(huán)三次的溶解氧變化曲線。由圖可知,BGM1、BGM5、BGM9 支架分別使溶液的飽和氧濃度達(dá)到(6.93±0.12)、(8.40±0.26)和(11.00±0.20) mg/L。除了BGM1 支架處理的溶液中飽和氧濃度很快下降到初始溶液的飽和氧濃度外,BGM5 和BGM9 支架處理的溶液中飽和氧濃度分別在13 和16 min 左右才開始逐漸下降,表明支架具有持續(xù)催化釋放氧氣的能力。另外,將試驗(yàn)的支架取出后再次放入到相同濃度的H2O2溶液,其處理溶液中的飽和氧濃度只有略微下降,說明BGM 支架表面的MnO2與支架產(chǎn)生較強(qiáng)的結(jié)合力,并且表面沉積的MnO2沒有在催化過程中被產(chǎn)生的O2破壞。因此,BGM 支架在模擬人體炎癥環(huán)境中具有持續(xù)的催化分解H2O2產(chǎn)生氧氣的能力。

圖6 (A)BGM9 支架在不同濃度H2O2 溶液中的溶解氧水平和(B)BGM 支架在 2 mmol/L H2O2溶液中溶解氧變化曲線(連續(xù)循環(huán)測(cè)試3 次)Fig.6 (A) Dissolved oxygen levels in different concentrations of H2O2 solution after immersing BGM9 scaffolds,and (B) dissolved oxygen change curves in 2 mmol/L H2O2 solutions after immersing BGM scaffolds (cycle test for 3 times)

2.5 BGM 支架的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

圖7(A)是CCK-8 法檢測(cè)rBMSCs 在BG 和BGM支架上培養(yǎng)1、3 和7 d 的細(xì)胞增殖狀況,可以看到,隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),BG 和BGM 支架上的細(xì)胞明顯增殖。另一方面,當(dāng)細(xì)胞在各組支架上培養(yǎng)3和7 d 后,BGM1 和BGM5 支架上細(xì)胞增長(zhǎng)率顯著高于BG 支架,而BGM9 支架組則顯示出與BG 支架組相近的細(xì)胞增長(zhǎng)率,表明BGM1 和BGM5 支架能夠促進(jìn)rBMSCs 增殖。細(xì)胞在BGM 支架上的增殖一方面取決于支架釋放的具有生物活性的Si、Ca離子和支架周圍穩(wěn)定的pH 環(huán)境[44-45]。另一方面,BGM支架表面釋放適量的Mn離子也能促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附與增殖[46]。

圖7 (A)rBMSCs 細(xì)胞在BG 和BGM 支架上的增殖和(B)ALP 活性Fig.7 (A) Proliferation and (B) ALP activity of rBMSCs on BG and BGM scaffolds

通過分析細(xì)胞在BG 和BGM 支架上的ALP 活性情況,進(jìn)一步評(píng)估了rBMSCs 在BG 和BGM 支架上的初期成骨分化能力。圖7(B)是rBMSCs 在BG和BGM 支架上培養(yǎng)3 和7 d 的ALP 活性表達(dá)水平。隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),BG 和BGM 支架組的ALP活性都隨之增大。當(dāng)細(xì)胞在各組支架上培養(yǎng)3 d 時(shí),BGM1 和BGM5 支架組的ALP 活性明顯高于BG支架組,而BGM9 支架組的ALP 活性接近BG 支架組。當(dāng)細(xì)胞在各組支架上培養(yǎng)7 d 時(shí),BGM5 和BGM9 支架組的ALP 活性明顯高于BG 支架組。這說明BGM5 支架對(duì)rBMSCs 有較好的成骨分化促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

本研究采用簡(jiǎn)單的氧化還原法在3D 打印制備的BG 支架表面沉積MnO2納米顆粒,得到了BGM復(fù)合支架。通過調(diào)節(jié)KMnO4溶液濃度可以調(diào)控BGM 支架表面MnO2的沉積量。BGM 支架具有規(guī)則的連通多孔結(jié)構(gòu),且不同MnO2量的BGM 支架具有相近的孔隙率和降解速率。隨著沉積MnO2量的增加,BGM 支架的抗壓強(qiáng)度也明顯增加。更為重要的是,BGM 支架能夠催化分解 H2O2產(chǎn)生氧氣,BGM5 和BGM9 支架在2 mmol/L H2O2溶液中持續(xù)產(chǎn)生氧氣,飽和氧濃度分別達(dá)到8.4 和11 mg/L。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BGM 支架對(duì)細(xì)胞增殖和成骨分化具有促進(jìn)作用。因此,BGM 支架具有消除骨缺損處過量H2O2并緩解缺氧狀態(tài)的功能,在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。