劉春，朱超，臧雨峰，黃必軍，何博，張振，張玉發(fā)，錢明

(1.青島大學附屬上海德濟醫(yī)院骨科，上海 200331；2.青島大學附屬上海德濟醫(yī)院檢驗科，上海 200331；3.海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003)

脊柱感染發(fā)病率為0.004‰～0.01‰，其死亡率為2%～4%，其中以胸腰椎感染多見[1-2]。主要原因是病原體在脊柱部位的定植，其病原體包括細菌、真菌、病毒及結(jié)核分支桿菌等。脊柱感染包括脊椎骨髓炎、椎間盤炎和硬膜外膿腫等，常由遠處病灶血行播散至1個或多個椎體引起，其他感染原因還包括臨床有創(chuàng)操作，如穿刺操作、針灸、手術(shù)等，也可見于鄰近組織播散等[2-5]。脊柱感染的診斷主要根據(jù)臨床癥狀、體征、實驗室檢查、影像學檢查等，常規(guī)微生物培養(yǎng)作為感染診斷的直接證據(jù)是診斷感染的金標準[2，6-7]，但其存在需要足夠細菌載量、培養(yǎng)周期較長以及假陰性率高等諸多不足，不利于感染疾病的快速精確診斷。目前隨著基因檢測技術(shù)的進步，宏基因二代測序(next-generation sequencing technology，NGS)技術(shù)在腦脊液、血液、假體周圍感染等標本中的諸多檢測優(yōu)勢已逐步展現(xiàn)[8-11]，目前感染科、呼吸科已廣泛用于血液、體液標本的檢測。金文婷等[5]2020年曾報道通過CT引導穿刺抽取感染病灶送檢NGS及常規(guī)微生物培養(yǎng)，NGS在病原檢測陽性率、檢測周期方面均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，能夠快速的檢測出致病原，指導臨床早期精確治療。但目前關于脊柱感染的NGS檢測相關研究較少，本研究通過手術(shù)取出脊柱感染病灶組織，同時行NGS及培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測，對兩者檢測陽性率、檢測周期進行回顧性對比分析，探討NGS在脊柱感染診治中臨床價值，研究結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年6月至2020年12月年在青島大學附屬上海德濟醫(yī)院行開放手術(shù)治療的脊柱感染患者的臨床資料進行回顧性對比分析研究，本次統(tǒng)計病例共計80例，去除后期病理檢測證實為腫瘤9例，未送檢NGS檢測14例，共57例納入研究。57例中男性41例，女性16例；年齡21～76歲，平均年齡為(55.32±12.56)歲。感染部位：頸椎10例，胸椎20例，腰椎27例。脊柱感染診斷參考2019年歐洲核醫(yī)學協(xié)會、歐洲骨與關節(jié)感染學會和歐洲放射學會聯(lián)合發(fā)布的外周骨感染診斷指南[12]，包括：(1)可能存在部分神經(jīng)功能障礙；(2)實驗室檢查：C-反應蛋白及血沉偏高，血白細胞、降鈣素原可正常；(3)可有發(fā)熱病史，伴有病變部位疼痛；(4)影像學檢查提示脊柱骨質(zhì)侵犯，骨髓水腫、侵蝕[12-13]。手術(shù)指征包括：(1)神經(jīng)癥狀進行性加重，病程>3個月；(2)疼痛視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS)≥5分；(3)胸腰椎日本骨科協(xié)會(Japanese orthopaedic association，JOA)評分≤15分。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)年齡>18歲；(2)綜合術(shù)前影像學檢查及實驗室檢查、病史等資料，初步診斷脊柱感染；(3)有疼痛、麻木感等神經(jīng)癥狀。排除標準：(1)術(shù)后病理證實為腫瘤；(2)未送檢NGS或培養(yǎng)基培養(yǎng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.3 脊柱病灶組織取樣方法 57例均行后路開放手術(shù)，取出病灶組織同時送檢NGS及常規(guī)微生物培養(yǎng)。

1.4 檢測方法

1.4.1 常規(guī)微生物培養(yǎng) 標本接種于分區(qū)劃線的血平板和巧克力平板，血平板、巧克力平板放CO2培養(yǎng)箱。35 ℃培養(yǎng)18～24 h。病灶組織標本成組織勻漿，分別接種于血瓊脂平板細菌培養(yǎng)，接種于念珠菌顯色平板行真菌培養(yǎng)，分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)(MGIT960)進行分枝桿菌培養(yǎng)。

1.4.2 NGS檢測 樣本處理和DNA提取：按照標準樣本采集流程采集標本，進行物理破壁、酶破壁，混合震蕩后取300μL樣本按照TIANamp Micro DNA Kit試劑盒步驟提取DNA。文庫構(gòu)建和測序：對提取好的核酸進行酶切片段化、末端修復、接頭連接及聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行文庫構(gòu)建，使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫片段大小為300 bp左右，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit質(zhì)控DNA文庫濃度，檢測后的濃度按照等質(zhì)量進行混合測序，混合后的文庫經(jīng)環(huán)化形成單鏈。再經(jīng)復制加載到測序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000進行測序。數(shù)據(jù)分析：通過bwa序列比對將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復雜度reads后與華大pmdb病原數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)的高低以及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。

2 結(jié) 果

2.1 檢測細菌分析 通過NGS檢測出細菌病例數(shù)達到28例，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)檢測出細菌病例數(shù)為9例，兩者對比差異有統(tǒng)計學意義(F=13.579，P<0.001)，NGS檢測方法具有顯著性優(yōu)勢(見表1)。

表1 NGS與常規(guī)微生物培養(yǎng)檢出結(jié)果(例)

57例中NGS檢測陽性共計38例，陽性率66.7%，陽性結(jié)果中細菌感染共28例，占73.7%。NGS檢測出序列數(shù)最高的主要致病細菌以葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌為主，其中6例存在3種以上細菌混合感染，7例存在2種細菌混合感染，15例為1種細菌感染，另外細菌感染合并其他微生物如結(jié)核、真菌感染多達15例。培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測陽性10例，陽性率26.3%，細菌9例、真菌1例(見表2，見圖1)。

表2 主要致病細菌結(jié)果分布(例)

圖1 NGS檢測細菌種類詳細分布圖

2.2 真菌、病毒、結(jié)核分枝桿菌結(jié)果分析 NGS檢測結(jié)果，真菌感染陽性8例(14.0%)，病毒檢測陽性12例(21.1%)，結(jié)核分支桿菌陽性12例(21.1%)。常規(guī)微生物培養(yǎng)僅有真菌1例陽性。

2.3 檢測周期結(jié)果分析 常規(guī)微生物培養(yǎng)檢測周期3～7 d，平均時間(5.0±2.1)d；NGS檢測周期24～36 h，平均時間(30.4±6.2)h。NGS檢測相比常規(guī)微生物培養(yǎng)檢測所需周期更短。

3 討 論

脊柱感染發(fā)病率較低，感染科、骨科及影像科醫(yī)生很難將其與非感染性疾病相區(qū)分。以往的檢測技術(shù)(如常規(guī)微生物培養(yǎng))很難明確致病原，脊柱感染確診多數(shù)依賴于臨床、實驗室及影像學資料，血液培養(yǎng)陽性率較低，病灶組織無法獲取送檢標本，且培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率僅35%左右[5]。培養(yǎng)周期相對較長，臨床治療多依賴于經(jīng)驗性抗感染，缺乏針對性。對于難以診斷的脊柱感染病例，診斷學穿刺是確診及鑒別診斷的最佳方案。既往研究報道經(jīng)CT引導下穿刺的陽性率為47%～100%。若穿刺前已進行抗感染治療，活檢微生物結(jié)果極大可能出現(xiàn)假陰性。金文婷等[5]曾研究CT引導穿刺取出病灶組織送檢NGS指導臨床治療，NGS作為新一代檢測手段，在脊柱感染早期快速診斷、開展精準治療方面具有更大的優(yōu)勢，通過人類基因庫數(shù)據(jù)比對，NGS檢測在膿毒血癥[14]、假體周圍感染[15]、中樞感染[16]中已展示出快速、準確的優(yōu)勢。本研究中，對于符合手術(shù)指征的病例，采用開放手術(shù)取出病灶組織行NGS檢測，發(fā)現(xiàn)NGS檢測有利于快速明確脊柱感染的致病原，為臨床早期精準治療提供關鍵的病原學依據(jù)。

作者觀察的38例檢測陽性病例中微生物分布以細菌為主，占陽性結(jié)果的73.7%，與以往臨床研究結(jié)果一致[17]。NGS檢測周期一般為24～36 h，相比常規(guī)微生物培養(yǎng)周期(需要72 h以上)，檢測周期明顯減少，為臨床早期、快速治療創(chuàng)造了條件。在厭氧菌感染中，李冰等[14]曾報道NGS檢測陽性率達到82.76%；而在假體周圍感染病例中，郝林杰等[8]曾報道NGS檢測陽性率也達到88.2%。金文婷[5]曾報道NGS檢測在脊柱感染病例中陽性率達到62.5%，與本研究的66.7%陽性率基本相一致。

本研究中，結(jié)核分枝桿菌NGS檢測陽性12例，陽性率達到21%，檢測周期平均(24±8)h，與文獻報道肺外結(jié)核發(fā)病率10%以上相符合[18]。然而12例結(jié)核菌感染病例常規(guī)微生物培養(yǎng)無陽性病例，因此NGS在檢測結(jié)核菌感染中具有明顯的優(yōu)勢。

在常規(guī)微生物培養(yǎng)陽性率較低的真菌中，NGS檢測陽性率也達到14%，與文獻報道真菌感染陽性率11.3%一致，脊柱感染以念珠菌及曲霉菌最為常見[19]。甚至在無法培養(yǎng)的病毒感染病例中，NGS檢測陽性率達到了21.1%。楊新明卜等[20]曾報道布氏桿菌脊柱感染病例中，手術(shù)取標本送檢膿液培養(yǎng)陽性結(jié)果率僅50%。本研究中有1例初步診斷感染病例中，曾使用萬古霉素、美羅培南等多種高級抗生素治療，體溫無法控制，炎癥指標持續(xù)上升，通過NGS檢測，術(shù)后24 h即快速明確診斷為布氏桿菌感染，術(shù)后針對病原菌抗感染治療后癥狀得以控制，患者臨床療效較好。

綜上所述，對比常規(guī)微生物培養(yǎng)，NGS檢測在細菌感染病例中檢測陽性率更高同時周期更短，特別是在真菌、病毒感染病例中具有顯著性優(yōu)勢，且在部分非特異性感染病例中，諸如布氏桿菌、結(jié)核分支桿菌等培養(yǎng)基培養(yǎng)無法明確的微生物具有絕對的優(yōu)勢[21-22]。因此，NGS檢測技術(shù)在脊柱感染手術(shù)治療病例中發(fā)揮了重要的作用，值得大力推廣。本文病例基數(shù)少，缺乏大樣本數(shù)據(jù)分析，且隨訪周期相對較短，還需要更長時間隨訪、更高質(zhì)量的隨機對照研究評估NGS在脊柱感染中的臨床應用價值。