陳成，李蕾，畢會(huì)敏，范方宇

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白，含有90%以上的蛋白質(zhì)[1]。大豆分離蛋白作為制備可食用食品包裝膜的成膜基質(zhì)，具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、環(huán)境友好以及成膜性好等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。但純大豆分離蛋白膜存在阻隔性弱、穩(wěn)定性差、易溶于水等不足[4]。近年來(lái)，已有不少學(xué)者對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性或添加天然材料的方法改善大豆分離蛋白膜的缺陷[5]。

花青素是自然界中一類廣泛存在于植物體內(nèi)的類黃酮物質(zhì)，使植物呈現(xiàn)各種顏色[6-7]?；ㄇ嗨卦诓煌琾H環(huán)境下結(jié)構(gòu)不同，當(dāng)pH小于3，花青素主要以紅色的黃烊鹽離子為主，pH大于7時(shí)花青素轉(zhuǎn)換為藍(lán)色的醌式堿[8]。目前，已有學(xué)者根據(jù)這一特點(diǎn)，將花青素添加到不同成膜基質(zhì)中以研究花青素對(duì)復(fù)合膜性能的影響，并探討其在食品保鮮色敏指示領(lǐng)域的應(yīng)用[9-13]。冉銳敏等[2]以葡萄皮紅、納米氧化鋅和大豆分離蛋白為原料制備復(fù)合膜，發(fā)現(xiàn)葡萄皮紅的添加可提高納米氧化鋅和大豆分離蛋白的相容性，同時(shí)葡萄皮紅能與納米氧化鋅發(fā)揮協(xié)同作用增強(qiáng)大豆分離蛋白膜機(jī)械性能、耐水性能和熱穩(wěn)定性。Liu等[14]研究紫甘藍(lán)花青素添加量對(duì)羧甲基纖維素鈉/聚乙烯復(fù)合膜pH敏感性和物理性能方面的影響，發(fā)現(xiàn)花青素能增強(qiáng)羧甲基纖維素鈉和聚乙烯的相容性，較低添加量的花青素復(fù)合膜對(duì)豬肉新鮮度檢測(cè)比較高花青素添加量復(fù)合膜更敏感。封晴霞等[15]以藍(lán)莓花青素為新鮮度指示劑，與玉米淀粉和羧甲基纖維素制成混合膜，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素與兩種成膜基質(zhì)相容性良好，且復(fù)合膜能很好地應(yīng)用于牛肉鮮度檢測(cè)中。

紫甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitataf.rubra)作為十字花科(Cruciferae)農(nóng)作物的一種，在我國(guó)大部分地區(qū)均有種植[16]。本文從紫甘藍(lán)中提取花青素，以大豆分離蛋白為基材，探究不同紫甘藍(lán)花青素添加量對(duì)大豆分離蛋白復(fù)合膜阻隔、機(jī)械、熱穩(wěn)定性能的影響，利用掃描電鏡(SEM)、傅里葉紅外光譜(FTIR)、X-射線衍射儀(XRD)、差示量熱掃描儀(DSC)對(duì)膜進(jìn)行分析表征，并研究復(fù)合膜對(duì)不同pH環(huán)境的色敏性，以期為紫甘藍(lán)花青素制備新型指示膜的研發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫甘藍(lán)購(gòu)于云南省昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；大豆分離蛋白購(gòu)于德州谷神蛋白科技有限公司，食品級(jí)；檸檬酸、氫氧化鉀等均為分析純。

JHY-5000電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，廈門金河源；IRPrestige-21傅里葉紅外光譜儀，日本導(dǎo)津；UV-2600紫外分光光度計(jì)，蘇州島津；D8 Advance X-射線衍射儀，德國(guó)布魯克；MIRA4掃描電鏡，捷克泰思肯；DSC204F1差示量熱掃描儀，德國(guó)耐馳；FD5-3冷凍干燥機(jī)，美國(guó)金西蒙。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫甘藍(lán)花青素制備

紫甘藍(lán)預(yù)處理 紫甘藍(lán)去除最外層皮、梗，蒸餾水洗凈，50 ℃干燥36 h，粉碎過(guò)60目篩，收集篩下樣品，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

紫甘藍(lán)花青素提取 紫甘藍(lán)粉按料液比1∶3(g/mL)加入0.3%檸檬酸與95%乙醇的混合溶液(1:2，v/v)于50 ℃水浴浸提3 h，抽濾，45 ℃旋蒸濃縮后凍干，得紫甘藍(lán)花青素(PCA)。

1.2.2 PCA/SPI復(fù)合膜制備

稱取6.00 g大豆分離蛋白、2.40 g丙三醇倒入裝有100 mL蒸餾水的燒杯中，溶解后置于恒溫水浴磁力攪拌鍋內(nèi)以80 ℃、500 r/min水浴50 min，冷卻至室溫后加入一定量PCA，500 r/min水浴10 min取出，300 W超聲10 min進(jìn)行消泡，得成膜液。成膜液緩慢倒于光滑塑料培養(yǎng)皿上，流延成膜，50 ℃干燥24 h后置于溫度為25 ℃、濕度為50%的恒溫恒濕箱內(nèi)平衡48 h，揭膜。為研究PCA添加量對(duì)復(fù)合膜物理性能的影響，PCA添加比例為0%、5%、10%、15%、20%(w/w)。

1.3 性質(zhì)測(cè)定

1.3.1 透O2速率

復(fù)合膜透O2速率按照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 透CO2速率

40 mm × 25 mm稱量瓶?jī)?nèi)放入5.00 g KOH，用復(fù)合膜密封瓶口，石蠟密封。稱重后放于溫度為25 ℃、濕度為50%的恒溫恒濕箱內(nèi)7 d(168 h)，稱重并計(jì)算質(zhì)量差。復(fù)合膜透CO2速率依下式計(jì)算。

式中：QCO2為復(fù)合膜透CO2速率〔g/(m2·d)〕；Pm為測(cè)試時(shí)間內(nèi)稱量瓶的質(zhì)量差(g)；J為密封稱量瓶口的復(fù)合膜面積(1.26×10-3m2)；T為測(cè)試時(shí)間(d)。

1.3.3 透水蒸氣速率

40 mm × 25 mm稱量瓶?jī)?nèi)放入5.00 g CaCl2，用復(fù)合膜密封稱量瓶口，石蠟密封。稱重記錄，放于溫度為25 ℃、濕度為50%的恒溫恒濕箱內(nèi)7 d，稱重并計(jì)算質(zhì)量差。復(fù)合膜透水蒸汽速率依下式計(jì)算。

式中：WVP為復(fù)合膜透水蒸氣速率〔g·mm/(m2·d·kPa)〕；Pm為測(cè)試時(shí)間內(nèi)稱量瓶的質(zhì)量差(g)；h為復(fù)合膜厚度(mm)；J為密封稱量瓶口的復(fù)合膜面積(1.26×10-3m2)；T為測(cè)試時(shí)間(d)；Δp為復(fù)合膜兩側(cè)水蒸汽壓差(kPa)。

1.3.4 不透明度

復(fù)合膜不透明度按照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行測(cè)定。復(fù)合膜裁剪成10 mm × 20 mm，放于空比色皿內(nèi)，以空比色皿為空白對(duì)照試驗(yàn)組，測(cè)定復(fù)合膜吸光度值。復(fù)合膜不透明度按下式計(jì)算。

式中：C為復(fù)合膜不透明度(%)；A600為復(fù)合膜在600 nm處的吸光度值；h為復(fù)合膜厚度(mm)。

1.3.5 機(jī)械性能的測(cè)定

復(fù)合膜機(jī)械性能按照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。機(jī)械性能包括斷裂伸長(zhǎng)率(TS)和拉伸強(qiáng)度(EB)。

1.3.6 掃描電鏡分析方法

采用掃描電鏡(SEM)觀察復(fù)合膜微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。觀察復(fù)合膜截面時(shí)使用液氮對(duì)復(fù)合膜進(jìn)行脆斷，樣品噴金，觀察倍數(shù)10 000倍。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析方法

采用傅里葉紅外光譜分析復(fù)合膜官能團(tuán)。KBr壓片法制樣，取一定量樣品與KBr混合研磨后壓片，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.8 X-射線衍射分析方法

采用X-射線衍射分析儀對(duì)復(fù)合膜晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。衍射角2θ范圍為5～80°，掃描速度為5°/min。

1.3.9 差示量熱掃描儀分析方法

采用差示量熱掃描儀分析復(fù)合膜熱穩(wěn)定性?？折釄鍨閷?duì)照組，氮?dú)饬魉?0 mL/min，升溫速率10 ℃/min，掃描溫度60～200 ℃。

1.3.10 花青素pH敏感性測(cè)定

為驗(yàn)證PCA對(duì)pH的敏感性，將PCA配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，配制好的花青素溶液以1︰2(v/v)的比例加入到不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11)緩沖溶液中，充分搖勻混合溶液后放于暗處?kù)o置15 min，觀察混合溶液顏色變化并拍照記錄。

1.3.11 PCA/SPI復(fù)合膜色敏響應(yīng)

為驗(yàn)證PCA/SPI復(fù)合膜對(duì)pH變化的敏感性，將復(fù)合膜裁剪成40 mm × 40 mm，浸沒于不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11)緩沖溶液中，復(fù)合膜顏色發(fā)生變化后用鑷子取出放于干凈玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，50 ℃干燥12 h，觀察PCA/SPI復(fù)合膜顏色變化并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 阻隔性能分析

阻隔性能是判定膜對(duì)食品保鮮程度的指標(biāo)，阻隔性能越好說(shuō)明膜對(duì)食品具有較高的保鮮性能，復(fù)合膜阻隔性能主要包括透O2、透CO2和透水蒸氣[18]。

圖1為不同PCA添加量對(duì)復(fù)合膜阻隔性能的影響。與空白對(duì)照組(PCA添加量為0%)相比，添加PCA對(duì)復(fù)合膜透O2、透CO2率影響顯著(P<0.05)，當(dāng)PCA添加量為10%時(shí)，復(fù)合膜透O2、透CO2率最低。這可能是因?yàn)镻CA加入SPI成膜基質(zhì)后，PCA與SPI之間形成的作用力使復(fù)合膜變?yōu)橹旅艿慕Y(jié)構(gòu)，延長(zhǎng)氣體在復(fù)合膜中的遷移路徑，使得復(fù)合膜阻隔性能降低。PCA添加量較少時(shí)，所形成作用力無(wú)法阻隔大量氣體透過(guò)；但當(dāng)PCA添加量超過(guò)10%后，由于添加PCA量過(guò)多，導(dǎo)致SPI成膜基質(zhì)與PCA之間的氫鍵被破壞，使氣體阻率降低[17,19]。

水蒸氣透過(guò)率(WVP)是衡量復(fù)合膜隔絕空氣中水分的指標(biāo)，WVP越低說(shuō)明復(fù)合膜隔絕空氣中水分的能力越強(qiáng)，對(duì)食品的保鮮效果越好[20]。圖1b可知，復(fù)合膜WVP隨PCA添加量呈現(xiàn)先降后增的趨勢(shì)，PCA添加量為15%的復(fù)合膜WVP值最低。這主要是因?yàn)镾PI具有較高的親水性，因此PCA添加量為0%(純SPI膜)的WVP值最高，添加PCA后，純SPI膜透水性能得到改善使復(fù)合膜形成較為致密的結(jié)構(gòu)從而阻隔更多水分。

2.2 不透明度分析

不透明度是衡量復(fù)合膜作為食品包裝膜的另一重要指標(biāo)，不透明值越高，復(fù)合膜阻隔光的能力就越強(qiáng)，對(duì)食品的保鮮能力也越強(qiáng)[21]。

圖2為PCA添加量對(duì)復(fù)合膜不透明度的影響。PCA添加量從0%增至20%，PCA/SPI復(fù)合膜不透明度從74.12%增至124.02%，這是由于PCA添加量的增加填補(bǔ)了SPI基質(zhì)中的孔隙，PCA與SPI形成結(jié)構(gòu)更為致密的復(fù)合膜，阻礙光通過(guò)，同時(shí)PCA自身對(duì)于紫外光具有較好阻隔性能，使PCA/SPI復(fù)合膜不透明度與PCA添加量呈正相關(guān)關(guān)系[7,22]。

圖2 不同紫甘藍(lán)花青素添加量對(duì)復(fù)合膜不透明度的影響

2.3 機(jī)械性能分析

機(jī)械性能是衡量食品包裝膜的重要指標(biāo)，機(jī)械性能較好的食品包裝膜在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中能對(duì)食品起到較好的保護(hù)作用[15,19]。圖3為不同PCA添加量對(duì)PCA/SPI復(fù)合膜機(jī)械性能的影響。復(fù)合膜機(jī)械性能隨PCA添加量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)且復(fù)合膜在PCA添加量為15%時(shí)具有較好的機(jī)械性能。PCA/SPI復(fù)合膜TS和EB分別從0%PCA添加量的1.44 MPa、64.67%增至15%PCA添加量的2.14 MPa、129.38%。這可能是因?yàn)樘砑覲CA后，PCA與SPI均勻混合形成致密結(jié)構(gòu)，提升復(fù)合膜機(jī)械性能，但當(dāng)PCA添加量超過(guò)15%時(shí)，過(guò)量的PCA會(huì)使SPI蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中鍵合作用減弱，加之PCA自身團(tuán)聚從而使復(fù)合膜機(jī)械性能降低。

圖3 不同紫甘藍(lán)花青素添加量對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響

2.4 掃描電鏡分析

通過(guò)掃描電鏡(SEM)分析復(fù)合膜表面、截面結(jié)構(gòu)，復(fù)合膜表面、截面越粗糙說(shuō)明PCA與SPI之間的相容性越差[23]。圖4為不同PCA添加量復(fù)合膜表面、截面掃描電鏡。SPI膜(0%PCA添加量)表面不平整，存在許多小團(tuán)粒和空隙。隨著PCA添加量增加，膜內(nèi)空隙逐漸減少，當(dāng)PCA添加量超過(guò)15%時(shí)，復(fù)合膜表面SEM圖出現(xiàn)細(xì)小孔隙和顆粒。這主要是因?yàn)镻CA能填充SPI蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得復(fù)合膜內(nèi)部空隙減少，結(jié)構(gòu)致密，同時(shí)PCA中羥基與SPI中的羥基形成分子間氫鍵，使復(fù)合膜機(jī)械性能和相容性得到改善。但PCA添加量為20%時(shí)，由于SPI自身的團(tuán)聚作用，PCA添加量越大，與SPI之間的相容性越差，導(dǎo)致復(fù)合膜存在許多細(xì)小孔隙。通過(guò)圖4(b)復(fù)合膜截面SEM圖可知，當(dāng)PCA添加量超過(guò)15%時(shí)，復(fù)合膜出現(xiàn)細(xì)小顆粒，說(shuō)明添加過(guò)量花青素會(huì)使PCA與SPI之間的相容性變差，出現(xiàn)SPI團(tuán)聚，降低復(fù)合膜的機(jī)械性能[15]。這與之前復(fù)合膜阻隔性能、機(jī)械性能解釋一致。

(a) 復(fù)合膜表面SEM圖(b) 復(fù)合膜截面SEM圖

2.5 傅里葉紅外光譜分析

圖5為不同PCA添加量復(fù)合膜的傅里葉紅外光譜(FTIR)圖。與空白膜相比，PCA/SPI復(fù)合膜未出現(xiàn)新的特征峰，說(shuō)明添加PCA未改變膜的化學(xué)性質(zhì)。SPI、PCA、PCA/SPI復(fù)合膜的O-H伸縮振動(dòng)分別在3 466 cm-1、3 322 cm-1和3 292 cm-1處，復(fù)合膜O-H伸縮振動(dòng)峰向右偏移，說(shuō)明PCA和SPI之間為物理結(jié)合且復(fù)合膜中PCA和SPI分子間存在氫鍵相互作用[25]。PCA/SPI復(fù)合膜C-H伸縮振動(dòng)峰在2 958 cm-1處，與2 871 cm-1處SPI的C-H伸縮振動(dòng)相比向左發(fā)生偏移，說(shuō)明添加PCA后對(duì)復(fù)合膜C-H有明顯影響作用。復(fù)合膜C=O伸縮振動(dòng)峰在1 637 cm-1處，N-H彎曲的吸收峰分別在1 538 cm-1和1 260 cm-1處[1,5]。以上結(jié)果說(shuō)明PCA和SPI之間具有較好的相容性。

圖5 不同紫甘藍(lán)花青素添加量復(fù)合膜紅外光譜

2.6 X-射線衍射分析

通過(guò)X-射線衍射(XRD)分析不同PCA添加量對(duì)復(fù)合膜晶體結(jié)構(gòu)和相容性的影響，出現(xiàn)高而窄的衍射峰表明樣品結(jié)晶度高，低而寬的衍射峰則說(shuō)明樣品結(jié)晶度低[14]。PCA、SPI和純SPI膜在2θ為16.6°處有一高而窄的衍射峰，此外29.1°處還有一較弱衍射峰，這說(shuō)明PCA、SPI和純SPI膜結(jié)晶性高[7]。添加PCA后，復(fù)合膜在2θ為9.1°處的衍射峰消失，僅在2θ為26.6°時(shí)存在較弱衍射峰，說(shuō)明PCA與成膜基質(zhì)之間相容性良好，同時(shí)PCA和SPI中的氫鍵形成范德華力使復(fù)合膜結(jié)晶性減弱[7]。

圖6 不同紫甘藍(lán)花青素添加量復(fù)合膜XRD光譜圖

2.7 差示量熱掃描儀分析

通過(guò)樣品在監(jiān)測(cè)溫度范圍內(nèi)出現(xiàn)的吸熱峰分析樣品熔融溫度[19,25]。由圖7可知，與SPI相比，純SPI膜熱穩(wěn)定性較差，添加PCA可提高復(fù)合膜熔融溫度。純SPI膜熔融溫度為87.26 ℃，當(dāng)PCA添加量為15%時(shí)，復(fù)合膜熔融溫度最高，為138.47 ℃。這可能是因?yàn)樘砑覲CA后SPI和PCA分子之間形成了強(qiáng)烈的分子間作用力，需要更多的熱能對(duì)這些作用力進(jìn)行解離。PCA添加量較少時(shí)，PCA與SPI之間形成的作用力較弱，所需熱能也較少；結(jié)合SEM可以看出PCA添加過(guò)量時(shí)，花青素與大豆分離蛋白復(fù)合膜表面分布不均影響復(fù)合膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使20%PCA添加量復(fù)合膜的熔融溫度下降至101.84 ℃。在食品材料包裝中，提高復(fù)合膜熱穩(wěn)定性可延長(zhǎng)食品貨架期。

圖7 不同紫甘藍(lán)花青素添加量對(duì)復(fù)合膜熱性能的影響

2.8 復(fù)合膜pH值響應(yīng)性分析

圖8a為PCA在pH3～11環(huán)境下的顯色響應(yīng)。當(dāng)pH為3時(shí)，PCA為亮紅色，pH為4～7時(shí)，PCA由亮紅色變?yōu)闇\紅色，pH為8時(shí)，PCA為紫色，隨著溶液環(huán)境堿性增大，PCA從淺綠變?yōu)樯罹G。這主要是由于花青素的四種結(jié)構(gòu)在不同酸堿環(huán)境下引起的變化[15]。當(dāng)花青素在pH為2～3的環(huán)境中時(shí)，其主要以紅色的黃烊鹽離子為主，隨著pH值的增加，花青素中陽(yáng)離子與OH-離子結(jié)合后形成無(wú)色甲醇假堿，紅色逐漸變淡，當(dāng)pH大于8后，花青素部分結(jié)構(gòu)在堿性條件下極不穩(wěn)定，發(fā)生去質(zhì)子反應(yīng)，使PCA逐漸呈現(xiàn)藍(lán)綠色[11]。

圖8b為不同PCA添加量復(fù)合膜在pH3～11環(huán)境下的顯色響應(yīng)。各PCA添加量復(fù)合膜在pH3～11環(huán)境下顏色變化趨勢(shì)大致相同，均由酸性條件下的紅色逐漸變?yōu)闇\紅最后變?yōu)榫G色，這與PCA在不同pH環(huán)境下的顯色響應(yīng)變化一致，但與PCA本身顏色存在一定差異。PCA添加量為15%時(shí)，復(fù)合膜顏色響應(yīng)變化最為明顯。以上分析表明，以15%PCA添加量制備的復(fù)合膜對(duì)pH反應(yīng)敏感，可以通過(guò)復(fù)合膜顏色變化對(duì)食品鮮度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

(a) PCA(b) PCA/SPI復(fù)合膜

3 結(jié)論

本文研究PCA添加量對(duì)紫甘藍(lán)花青素/大豆分離蛋白復(fù)合膜性能及其對(duì)pH色敏性的影響。結(jié)果表明，15%PCA添加量的復(fù)合膜在機(jī)械性能、阻隔性能方面均有較好表現(xiàn)；復(fù)合膜不透明度隨PCA添加量增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；SEM分析表明，PCA與成膜基質(zhì)之間相容性較好；FTIR分析表明，添加PCA后復(fù)合膜化學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變；XRD分析表明，添加PCA會(huì)降低復(fù)合膜結(jié)晶度；DCS分析表明，PCA添加量為15%時(shí)的復(fù)合膜熱穩(wěn)定性最好，熔融溫度為138.47 ℃。通過(guò)PCA和復(fù)合膜pH響應(yīng)性分析表明，花青素和復(fù)合膜在pH3～11環(huán)境下的變化趨勢(shì)一致，過(guò)程為亮紅色—淺紅色—紫色—淺綠—深綠，同時(shí)15%PCA添加量復(fù)合膜在不同pH環(huán)境下顏色變化最敏銳。