司 海 劉 然 熊中原 曹邦偉

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)教研室，山東濰坊 261053；2.北京市平谷區(qū)醫(yī)院病理科，北京 101200；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤中心，北京 100050)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率居高不下。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]顯示：其發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中分別位列第3位(10.00%)和第2位(9.40%)；在中國，結(jié)直腸癌在所有惡性腫瘤中的發(fā)病率和病死率分別位列第2位(12.20%)和第5位(9.50%)[2]。因此，探究新的分子標志物對提高結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷與診療具有重要意義。

細胞角蛋白(cytokeratin，CK)是上皮細胞骨架的主要組成部分，主要作用是維持上皮組織的穩(wěn)定和完整，同時也是診斷病理學(xué)中用于檢測和分類上皮源性腫瘤的特異性標志物[3-6]。腺癌一般以單層上皮細胞角蛋白為主，特別是CK7、8、18～20[7]。因此，CK的表達有可能作為結(jié)直腸癌較為理想的輔助診斷指標。本研究檢測了結(jié)直腸癌及配對的癌旁正常組織中CK7、8、18～20的表達并分析其差異，目的是探究其在結(jié)直腸癌組織中的表達與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取北京市平谷區(qū)醫(yī)院2013年至2021年行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者的病理組織蠟塊標本。納入標準：①經(jīng)病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌；②首次手術(shù)，且術(shù)前均未行放射治療(以下簡稱放療)、化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)及靶向治療。③病例資料完整。排除標準：合并其他原發(fā)惡性腫瘤者。最終納入200例，其中男性100例、女性100例。本研究經(jīng)市平谷區(qū)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌及癌旁組織中CK7、8、18～20的表達

所有標本均經(jīng)10%(體積分數(shù))甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。免疫組織化學(xué)法采用MaxVision法，石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化和沖洗，并用抗原修復(fù)緩沖液進行抗原修復(fù)。一抗為鼠抗人CK7(貨號：YM3054)、CK8(貨號：YM3055)、CK18(貨號：YM6166)、CK19(貨號：YM6577)和CK20(貨號：YM6037)均購自Immunoway公司；二抗為MaxVision/HRP〗試劑(貨號：KIT-5002)購自中國福州邁新生物科技有限公司。DAB顯色，復(fù)染并封片。染色結(jié)果判斷：根據(jù)染色強度和陽性細胞百分率分析CK7、8、18～20的表達水平[8]。染色判定標準為(細胞質(zhì)著色情況)：無著色，0分；弱著色(淺黃色)1分；中等強度著色(棕黃色)2分；強著色(棕褐色)，3分。陽性細胞百分率的判定標準為：細胞質(zhì)著色為黃色或棕褐色，陽性細胞百分率≤5%計0分，6%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；≥76%計4分。最終評分為兩項評分之積，并定義0～2分為陰性，3～12分為陽性。免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果最終由兩名經(jīng)驗豐富的病理學(xué)專家雙盲判斷，評分如有差異，取兩者平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

納入的200例患者，年齡27～89(65.69±10.46)歲，<65歲94例、≥65歲106例；結(jié)腸癌100例，直腸癌100例；高分化5例、中分化170例、低分化25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移85例(42.50%)、遠處轉(zhuǎn)移6例(3.00%)。Ⅰ期33例(16.50%)、Ⅱ期75例(37.50%)、Ⅲ期86例(43.00%)、Ⅳ期6例(3.00%)。

2.2 CK7、8、18～20在結(jié)直腸癌與癌旁組織中的表達

CK7主要表達于細胞質(zhì)，在癌組織中表達陰性(圖1A)；在癌旁組織中，1.00%(2/200)的病例呈陽性表達，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.478)。CK8主要表達于細胞膜和細胞質(zhì)，在癌組織中有99.00%(198/200)的病例陽性表達(圖1B)；在癌旁組織中，91.50%(183/200)病例陽性表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。CK18主要表達于細胞質(zhì)，在癌組織中有94.50%(189/200)的病例表達陽性(圖1C)；在癌旁組織中有25.00%(50/200)的病例表達陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。CK19主要表達于細胞質(zhì)，在癌組織中有8.00%(16/200)的病例表達陽性(圖1D)；在癌旁組織中有3.00%(6/200)的表達陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)。CK20主要表達于細胞質(zhì)，在癌組織中有79.50%(159/200)的病例陽性表達(圖1E)；在癌旁組織中有11.00%(22/200)的病例表達陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。詳見表1。

表1 結(jié)直腸癌癌組織和癌旁正常組織中CK7、8、18～20的表達

圖1 CK7、8和CK18～20在結(jié)直腸腺癌組織中的表達

2.3 CK7、8、18～20的表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

CK7在癌及癌旁組織中均缺乏表達，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與患者臨床病理特征不相關(guān)。CK8和CK18～20的表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)。CK8與腫瘤的浸潤深度相關(guān)(P=0.048)，當(dāng)腫瘤穿透固有肌層到達漿膜下層時，CK8的陽性表達率更高。CK19與腫瘤有無發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.027)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤患者，CK19的陽性表達率更高。CK20與腫瘤的分化程度相關(guān)(P=0.010)，在中高分化的腫瘤組織中，CK20陽性表達率更高。詳見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者癌組織中CK8、18～20的表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 結(jié)直腸癌危險因素的Logistic回歸分析

以結(jié)直腸癌為因變量納入條件Logistic回歸分析，單因素結(jié)果顯示，CK8、CK18～20陽性為患結(jié)直腸癌的危險因素。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，CK18和CK20陽性為患結(jié)直腸癌的獨立危險因素。詳見表3。

表3 結(jié)直腸癌危險因素的Logistic回歸分析

3 討論

細胞角蛋白是臨床上常見的腫瘤標志物之一, 其與上皮細胞化生、惡變、腫瘤轉(zhuǎn)移等病變有關(guān)[9-10]。CK根據(jù)等電點的不同分為酸性(Ⅰ型)和堿性(Ⅱ型)形式，Ⅰ型細胞角蛋白(CK9～CK20)相對分子質(zhì)量小，呈酸性; 而Ⅱ型細胞角蛋白(CK1～CK8)相對分子質(zhì)量較大，呈堿性。

本研究顯示CK7在結(jié)直腸癌和癌旁組織中都缺乏表達，但有研究[11]顯示在部分結(jié)直腸癌亞型中有表達，比如在BRAF突變的微衛(wèi)星穩(wěn)定型(microsatellite stable,MSS)結(jié)直腸癌中，有39%的病例表達CK7。目前關(guān)于CK8在結(jié)直腸癌中的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)CK8在結(jié)直腸癌組織中的表達陽性率高于癌旁組織且與腫瘤的浸潤深度成正相關(guān)。但也有研究顯示[12]，CK8在結(jié)直腸癌中的低表達與腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關(guān)，其低表達提示腫瘤具有更強的侵襲性且預(yù)后更差，并且CK8的表達與腫瘤的浸潤、分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，造成這種差異的原因可能和本研究病例數(shù)目過少有關(guān)。在本研究中，CK18在結(jié)直腸癌組織中的表達陽性率高于癌旁組織，與腫瘤患者的臨床病理特征關(guān)聯(lián)性不高。也有研究[13-14]顯示CK18過表達可促進PI3k-AKT信號通路及EMT，加快結(jié)直腸癌細胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，從而與癌癥患者的生存率降低相關(guān)，可作為大腸癌患者預(yù)后的指標。有報道[15]稱CK19作為敏感標志物可提高大腸癌的早期診斷，在本研究中也發(fā)現(xiàn)CK19在結(jié)直腸癌組織中的表達陽性率高于癌旁組織，同時其表達與腫瘤患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，因此其高表達對于診斷和判斷患者預(yù)后具有一定的參考意義。CK20在胃腸上皮細胞以及由這些細胞衍生的腫瘤中都有表達[16-17]。本研究結(jié)果顯示，CK20在結(jié)直腸癌組織中的表達陽性率顯著高于癌旁組織，并且其表達陽性率隨著腫瘤分化程度的降低而降低。也有研究[18]顯示，結(jié)直腸癌患者血清中CK20 mRNA的表達明顯升高，可作為結(jié)直腸癌診斷的特異性血清標志物。

綜上所述，CK7在結(jié)直腸癌癌組織和癌旁組織中都缺乏表達；CK8、18～20在癌組織中的表達高于癌旁組織，其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起到一定的促進作用，并且其表達上調(diào)對于結(jié)直腸癌的診斷也具有一定的指導(dǎo)意義。筆者還發(fā)現(xiàn)CK18、CK19和CK20在癌組織中的表達分別與腫瘤的浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)。因此CK在結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤和分化中可能起到一定的作用，從而對臨床上判斷結(jié)直腸癌的惡性程度起到一定參考意義。但因本研究病例數(shù)目較少，且未深入探究CK與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，具有一定的局限性，后期將會擴大樣本量，探究其在結(jié)直腸癌患者預(yù)后中的作用及其機制。