孟 霞 李 夢(mèng) 王晶晶 張 靜, 2, 3 陳柏安, 2, 3* 盧 靜, 2, 3

(1.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)學(xué)系，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)再生修復(fù)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)聚集形成的斑塊是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)主要的神經(jīng)病變之一，其與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是研究AD發(fā)病機(jī)制及藥物治療的重要靶標(biāo)[1]。研究[2]顯示許多已知的AD風(fēng)險(xiǎn)因素會(huì)增加Aβ聚集及斑塊形成，研究Aβ斑塊在AD的研究中占重要的位置。研究[3]顯示AD患者腦內(nèi)的Aβ斑塊表現(xiàn)為致密型和彌散型。典型的致密型Aβ斑塊具有一個(gè)致密的核心，在核心周圍呈暈狀，又稱為日冕狀，在日冕狀外周呈不規(guī)則的彌漫狀斑塊。而不典型的致密型Aβ斑塊呈致密狀，缺乏日冕狀結(jié)構(gòu)。彌散型Aβ斑塊與致密型Aβ斑塊相比表現(xiàn)為分散或松散狀，像絮狀、星狀、條帶狀分布，其大小、形狀、密度、位置不一，規(guī)律性不強(qiáng)[4]，研究[5-6]顯示腦內(nèi)彌漫型Aβ斑塊比致密型Aβ斑塊出現(xiàn)更早且分布更廣。此外，在AD患者腦內(nèi)血管中也觀察到Aβ沉積，形成淀粉樣腦血管病變(cerebral amyloid angiopathy，CAA)[7]。在AD患者腦內(nèi)通?？梢夾β斑塊和CAA，是AD重要的神經(jīng)病變特征[8-9]。

腦內(nèi)Aβ生成增加或Aβ降解減少會(huì)導(dǎo)致Aβ聚集形成斑塊，淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因或早老素(presenilin,PSEN)基因突變是目前已知能導(dǎo)致腦內(nèi)形成Aβ斑塊的明確原因。Oakley等[10]和Jawhar等[11]陸續(xù)構(gòu)建了5xFAD(B6SJL)轉(zhuǎn)基因小鼠和5xFAD(C57BL6)轉(zhuǎn)基因小鼠，其攜帶人APP基因和PSEN1基因中5個(gè)AD相關(guān)的突變，包括APP中的突變K670N/M671L，I716V和V717I，以及PSEN1中的突變M146L和L286V。5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠早至2月齡時(shí)即在腦內(nèi)(包括海馬、皮質(zhì)和丘腦等)出現(xiàn)Aβ斑塊[12]，腦內(nèi)Aβ斑塊會(huì)誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。此外，5xFAD轉(zhuǎn)基因鼠約在3月齡時(shí)可見CAA[13]。因5xFAD攜帶了AD致病基因突變，且其腦內(nèi)發(fā)生Aβ斑塊和CAA很早，該小鼠廣泛應(yīng)用于Aβ斑塊相關(guān)的致病機(jī)制及AD治療的研究。

雖然5xFAD廣泛應(yīng)用于AD相關(guān)的致病機(jī)制及治療研究，但其腦內(nèi)的Aβ斑塊與AD患者腦內(nèi)的Aβ斑塊在形態(tài)、數(shù)量、類型等特征方面的異同至今未見詳細(xì)報(bào)道。本研究利用免疫熒光染色通過單克隆抗體(4G8)檢測(cè)了5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦中的Aβ斑塊，利用CaseViewer和GraphPad Prism 8軟件對(duì)其腦內(nèi)Aβ斑塊進(jìn)行了定性定量分析，比較了5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦中Aβ斑塊在形態(tài)、數(shù)量、類型等特征的異同。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本及動(dòng)物

(1)AD患者大腦組織樣本：AD患者大腦組織由北京師范大學(xué)崔孟超教授惠贈(zèng)，包括AD1(95歲，女性)、AD2(85歲，男性)，AD3(64歲，女性)大腦組織包括顳葉皮質(zhì)和海馬。

(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：5xFAD小鼠(Tg6799，MMRRC品系號(hào)：34840-JAX)來自Jackson實(shí)驗(yàn)室，5xFAD小鼠與C57BL/6小鼠繁殖后代，根據(jù)Jackson實(shí)驗(yàn)室的方法取小鼠尾尖DNA通過PCR鑒定基因型。本研究使用12月齡5xFAD小鼠3只，包括5xFAD1(雄性)、5xFAD2(雌性)，5xFAD3(雌性)，在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部屏障環(huán)境飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0012，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：AEEI-2015-020)。

1.2 小鼠心臟灌注固定取大腦

小鼠腹腔注射1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)，經(jīng)深度麻醉后，使用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，直至小鼠四肢僵硬，取大腦組織，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛浸泡固定48 h。

1.3 大腦組織免疫熒光染色

固定后的大腦組織脫水包埋，切片(厚度4 μm)待用，石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘片2h，脫蠟、水化后，PBS沖洗3次，5 min/次；EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10 min低火至沸；自然冷卻后PBS洗3次，5 min/次；3%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫溶液中室溫孵育10 min；PBS洗滌3次；5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的BSA封閉20 min；Aβ特異性單克隆抗體4G8(1∶200，800701，Biolegend公司)進(jìn)行免疫熒光染色。

1.4 圖像分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用CaseViewer軟件采集圖像，GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行圖像統(tǒng)計(jì)分析，在不同放大倍數(shù)下觀察腦內(nèi)Aβ斑塊分布、形態(tài)、直徑、數(shù)量等特征。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠及AD患者大腦中Aβ斑塊類型檢測(cè)結(jié)果

5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和AD患者大腦(海馬和皮質(zhì))中均可見明顯的Aβ斑塊，其中致密型Aβ斑塊，結(jié)構(gòu)致密，形似球狀；彌散型Aβ斑塊，結(jié)構(gòu)疏松，形似絮狀(圖1)。

2.2 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦CAA檢測(cè)結(jié)果

5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦血管壁上均可見明顯紫紅色的Aβ沉積形成的CAA，形似環(huán)狀。5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中CAA的形態(tài)與AD患者大腦中的CAA高度相似(圖2)。

圖2 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦中均可見明顯的CAA

2.3 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦中Aβ斑塊檢測(cè)結(jié)果

AD患者大腦中有大小不一的Aβ斑塊，按照其直徑可分為5類，其直徑分別為<15 μm、[15，30)μm、[30，45)μm、[45，60)μm、以及60 μm。與AD患者相似，在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中也可見上述5類直徑范圍的Aβ斑塊(圖3)。

圖3 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦中均有大小不一的Aβ斑塊

2.4 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦中相同面積內(nèi)不同直徑Aβ斑塊數(shù)量比較

對(duì)5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦相同面積(62 464 μm2)內(nèi)不同直徑的Aβ斑塊數(shù)量進(jìn)行了定量分析。5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)直徑為[45，60)μm和≥60 μm的Aβ斑塊數(shù)量與AD患者相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.167、P=0.159)；而直徑為[15,30)μm和[30,45)μm的Aβ斑塊數(shù)量高于AD患者，直徑<15 μm的Aβ斑塊數(shù)量則低于AD患者，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦中相同面積內(nèi)不同直徑Aβ斑塊數(shù)量的異同

2.5 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦中Aβ斑塊類型及形態(tài)比較

在AD患者腦內(nèi)主要可見彌散型Aβ斑塊、不典型的致密型Aβ斑塊以及典型的日冕狀致密型Aβ斑塊(圖5A)，但是在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)主要可見彌散型Aβ斑塊、不典型的致密型Aβ斑塊(圖5B)，未見典型的日冕狀致密型Aβ斑塊(圖5C)。

3 討論

5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶了人APP基因和PSEN1基因中5個(gè)AD相關(guān)的突變，導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ生成增加，隨年齡增長在其腦內(nèi)可見Aβ斑塊[10-11]。本研究選用老年5xFAD小鼠(12月齡)與年齡相當(dāng)?shù)睦夏闍D患者(>60歲)大腦組織，利用免疫熒光染色通過單克隆抗體(4G8)檢測(cè)了二者腦內(nèi)的Aβ斑塊。老年5xFAD小鼠腦內(nèi)可見彌散型Aβ斑塊和致密型Aβ斑塊，這與AD患者相同(圖1)。但是在AD患者腦內(nèi)可見典型的日冕狀致密型Aβ斑塊，而在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)未見該類Aβ斑塊。典型的日冕狀致密型Aβ斑塊與非典型的致密型Aβ斑塊及彌散型Aβ斑塊在形態(tài)上明顯不同(圖5)，研究[14]顯示隨著年齡增加和病程延長，典型的日冕狀致密型Aβ斑塊中的日冕狀結(jié)構(gòu)發(fā)生崩解，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)椴坏湫偷闹旅苄虯β斑塊，然而AD患者腦內(nèi)典型的日冕狀致密型Aβ斑塊是偶然形成還是受某種機(jī)制調(diào)控而形成尚不清楚。為何5xFAD小鼠腦內(nèi)未形成典型的日冕狀致密型Aβ斑塊，可能與小鼠腦內(nèi)環(huán)境與人差異大有關(guān)，具體原因尚待進(jìn)一步研究。此外，應(yīng)注意5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊是由于APP和PS1基因突變導(dǎo)致Aβ生成增多所致，這與家族性AD患者相似，但是散發(fā)性AD患者腦內(nèi)Aβ斑塊的形成與年齡、APOE基因分型、環(huán)境等多種因素有關(guān)?？傊?，5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與家族性AD患者腦內(nèi)Aβ斑塊形成的原因相似，而與散發(fā)性AD患者腦內(nèi)Aβ斑塊形成的原因差異大，但是5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)彌散型Aβ斑塊和致密型Aβ斑塊在形態(tài)上與AD患者高度相似，因此5xFAD小鼠是用于研究彌散型和致密型Aβ斑塊形成及致病機(jī)制的理想動(dòng)物模型。

圖5 5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠與AD患者大腦組織中Aβ斑塊的種類不完全相同

AD患者腦內(nèi)可見Aβ在血管中沉積形成的CAA，Aβ在血管中沉積會(huì)損傷血管的中層和外膜，促使基底膜增厚，導(dǎo)致血管腔狹窄，容易發(fā)生出血，破壞血-腦脊液屏障，損傷認(rèn)知功能[15-18]。在本研究中，5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)可見Aβ在血管中沉積形成CAA，其形態(tài)與AD患者腦內(nèi)的CAA高度相似，因此5xFAD小鼠也是用于研究CAA形成及致病機(jī)制的理想動(dòng)物模型。

研究[19-21]顯示AD患者腦內(nèi)Aβ斑塊隨時(shí)間推移逐步形成，即先形成小的彌漫型Aβ斑塊，之后隨著Aβ不斷聚集，逐漸形成致密型Aβ斑塊，體積也逐漸增大，甚至出現(xiàn)超大斑塊。但是，隨著年齡增長和病程進(jìn)展，大的致密型Aβ斑塊隨之崩解，又出現(xiàn)以大量小的彌散型Aβ斑塊為主的特征[22]，這提示了Aβ斑塊的形成可能存在動(dòng)態(tài)規(guī)律。本研究結(jié)果顯示在AD患者腦內(nèi)有大小不一的Aβ斑塊，包括直徑<15 μm、[15，30)μm、[30，45)μm、[45，60)μm以及≥60 μm這5類Aβ斑塊(圖3)，其中以直徑<15 μm的Aβ斑塊為主(圖4)。在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)也可見上述5類Aβ斑塊，其也以直徑<15 μm的Aβ斑塊為主，與AD患者相似，但是5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)直徑<15 μm的Aβ斑塊數(shù)量/62 464 μm2少于AD患者，直徑為[15，30)μm和[30，45)μm的Aβ斑塊數(shù)量/62 464 μm2則多于AD患者，而直徑為[45，60)μm和≥60 μm的Aβ斑塊數(shù)量/62 464 μm2與AD患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。本研究結(jié)果提示5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)直徑>45 μm的Aβ斑塊數(shù)量/62 464 μm2與AD患者相似，而小于45 μm的Aβ斑塊數(shù)量/62 464 μm2與AD患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此在利用5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠開展Aβ斑塊相關(guān)研究時(shí)應(yīng)考慮這些與AD患者異同的因素。

致謝：感謝北京師范大學(xué)崔孟超教授惠贈(zèng)該研究中的AD患者腦組織。