李 珺 李碩碩 彭志鑫 廖亞金 程金波* 袁增強(qiáng)*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)腦重大疾病研究院，北京 100069；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；3.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，湖南衡陽(yáng) 421001；4.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100081)

我國(guó)幅員遼闊，高原地區(qū)國(guó)土面積位居世界第一。在醫(yī)學(xué)上，高原是指能引起機(jī)體生物學(xué)效應(yīng)的海拔高達(dá)2 500米以上的廣泛地區(qū)[1]。高原地區(qū)溫度低，溫差大，濕度低，陽(yáng)光輻射強(qiáng)烈，而低壓低氧是最為顯著的特點(diǎn)[2]。宏觀上，中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官——腦，對(duì)于低氧十分敏感，氣壓降低導(dǎo)致供氧穩(wěn)態(tài)的失衡，引起腦血管重構(gòu)導(dǎo)致血管源性腦水腫[3]及機(jī)體認(rèn)知障礙[4-5]。微觀上，細(xì)胞缺氧導(dǎo)致線粒體功能異常，產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[6-7]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下ROS的升高可以激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的促炎因子，進(jìn)一步加劇了神經(jīng)炎性反應(yīng)[8]。近年來(lái)有研究[9]顯示，組蛋白去乙?；?histone deacetylases 3，HDAC3)在巨噬細(xì)胞中，通過(guò)非乙?；饔靡鸺?、慢性炎癥，巨噬細(xì)胞中HDAC3的缺失，可以減少線粒體膜的破壞，使ROS的產(chǎn)生減少。本課題組前期研究工作顯示，急性缺血缺氧導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化，神經(jīng)炎癥水平升高。敲除小膠質(zhì)細(xì)胞HDAC3可以緩解缺血缺氧導(dǎo)致的腦損傷和神經(jīng)炎癥[10]。目前，高原低壓低氧環(huán)境導(dǎo)致腦損傷產(chǎn)生的分子機(jī)制還不清楚。本研究利用高原低氧倉(cāng)與低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱模擬高原環(huán)境處理小鼠和小膠質(zhì)細(xì)胞，利用蛋白質(zhì)免疫印跡和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)等技術(shù)，探究高原缺氧是否會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，以及HDAC3是否在這一過(guò)程中發(fā)揮作用，為高原性腦病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(購(gòu)于斯貝福生物技術(shù)有限公司)；實(shí)驗(yàn)室飼育的HDAC3flox/flox和HDAC3flox/flox；CX3CR1CreER小鼠[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：syxk(軍)2019-0004][10]。袁增強(qiáng)課題組實(shí)驗(yàn)室凍存的BV2細(xì)胞系和穩(wěn)定敲低HDAC3的BV2細(xì)胞系。

將HDAC3flox/flox小鼠與CX3CR1CreER小鼠雜交，使其產(chǎn)生后代HDAC3flox/flox; CX3CR1CreER小鼠(cKO小鼠)，利用他莫昔芬(tamoxifen)灌胃誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除HDAC3。

1.2 主要試劑和儀器

ROS檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：S0033S)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)：C11885500BT)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金生物技術(shù)公司，貨號(hào)：O10306)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(美國(guó)BD Biosciences公司，貨號(hào)：610332，1∶1 000配制)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factors-1α, HIF-1α)抗體(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab179483，1∶1 000配制)，超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase，SOD)抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：S0088，1∶1 000配制)，HDAC3抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：85057S，1∶1 000配制)，HDAC3抑制劑RGFP966(美國(guó)Selleck Chemicals公司，貨號(hào)：S7229)。

1.3 高原缺氧小鼠模型建立

將14只2月齡健康C57BL/6J雄鼠使用簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法分成2組，常壓常氧組(常氧組)、低壓低氧組(低氧組)各7只。常氧組在正常氧環(huán)境下喂養(yǎng)，低氧組置于模擬 6 000米海拔環(huán)境的低壓氧艙，每3天降艙后，加食、喂水。將14只2月齡HDAC3flox/flox雄性小鼠使用簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法分成常氧組、低氧組各7只，常氧組在正常氧環(huán)境下喂養(yǎng)，低氧組置于模擬 6 000米海拔環(huán)境的低壓氧艙，每3天降艙后，加食、喂水。連續(xù)飼養(yǎng)7 d后斷頸處死小鼠，取小鼠腦組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 缺氧細(xì)胞模型建立

BV2細(xì)胞以及穩(wěn)定敲低HDAC3的BV2細(xì)胞分別分為5組，以60%的密度鋪于12孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，12 h更換培養(yǎng)基后，一組常氧培養(yǎng)(常氧組)，另四組(低氧組)放入低氧培養(yǎng)箱，通入0.1%(體積分?jǐn)?shù))氧氣，5%(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳，分別低氧處理2、4、6、8 h，然后收集樣品進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.5 RGFP966處理細(xì)胞

將RGFP966粉末溶于二甲基亞砜(DMSO)中，制成6 mmol/L母液，處理細(xì)胞終濃度為6 μmol/L。加入RGFP966后進(jìn)行低氧處理2、4、6、8 h，然后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 ROS檢測(cè)

按照1∶1 000比例用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA母液至終濃度為10 μmol/L，準(zhǔn)備ROS染色試劑。然后將培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)液棄去，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA進(jìn)行染色。于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌多余染料，之后收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值，使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。

1.7 mRNA的檢測(cè)

加入500 μL/孔Trizol 提取細(xì)胞總RNA和腦海馬組織總RNA，用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。然后取1 μg總RNA用 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書(shū)方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后用real-time PCR法檢測(cè)HIF-1α、HDAC1/2/3、iNOS、CD206、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、SOD的mRNA水平。所用PCR引物如表1所示。

表1 PCR引物

1.8 Western blotting法測(cè)定組織和細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blotting法測(cè)定各組HIF-1α、HDAC3、iNOS、SOD蛋白表達(dá)，β-actin 作為內(nèi)參標(biāo)記蛋白。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，對(duì)應(yīng)一抗標(biāo)記，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗結(jié)合后ECL顯色液顯影，X線曝光，掃描各條帶灰度值，Image J分析條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 低壓低氧暴露對(duì)小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響

通過(guò)real-time PCR檢測(cè)低氧組小鼠和常氧組小鼠海馬區(qū)的iNOS、SOD、HIF-1α的mRNA水平。結(jié)果顯示，兩組間低氧相關(guān)因子HIF-1α及炎癥因子CD206、ARG1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但低氧組iNOS和SOD的濃度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，低氧組HDAC3濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而HDAC1以及HDAC2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 低壓低氧暴露后小鼠腦部海馬區(qū)相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

2.2 低氧處理對(duì)BV2小膠質(zhì)氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響

利用低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱模擬高原低氧環(huán)境對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行低氧處理[1%(體積分?jǐn)?shù))O2]2、4、6、8 h后，通過(guò)real-time PCR檢測(cè)HIF-1α、iNOS、HDAC3、SOD的mRNA水平。結(jié)果顯示，低氧處理組和常氧組低氧相關(guān)因子HIF-1α水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但低氧處理組iNOS、SOD和HDAC3的水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)以及灰度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示低氧處理組HIF-1α、iNOS和HDAC3的蛋白表達(dá)量明顯高于常氧組。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS探針熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示低氧組ROS的濃度明顯高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 低氧處理增加小膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平

2.3 抑制HDAC3減輕低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平

RGFP966處理顯著抑制了低氧導(dǎo)致的iNOS、SOD的mRNA表達(dá)水平的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示RGFP966處理顯著抑制了低氧導(dǎo)致的iNOS蛋白表達(dá)水平的升高。從mRNA和蛋白水平確定HDAC3穩(wěn)定敲低細(xì)胞株具有較好的敲低效果。低氧處理后，結(jié)果顯示低氧處理4 h，HIF-1α的mRNA水平?jīng)]有顯著改變，但敲低HDAC3的細(xì)胞中HIF-1α蛋白水平較未敲低組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且敲低HDAC3顯著降低了低氧暴露后iNOS和SOD的mRNA升高和iNOS蛋白增加。與此一致，敲低HDAC3顯著降低了低氧誘導(dǎo)的ROS升高。詳見(jiàn)圖3。

2.4 特異性敲除小膠質(zhì)細(xì)胞HDAC3可減輕低壓低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)

首先檢測(cè)HDAC3的敲除效率，通過(guò)分選腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行Western boltting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HDAC3的表達(dá)水平在HDAC3flox/flox；CX3CR1CreER小鼠中顯著下降(圖4A)。隨后，將cKO小鼠與野生型小鼠置于低壓低氧艙中，模擬6 000米海拔高度連續(xù)處理7 d(圖4B)。結(jié)果顯示，低壓低氧暴露后iNOS和SOD的mRNA水平在cKO小鼠中顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4C、4D)。

圖4 特異性敲除小膠質(zhì)細(xì)胞HDAC3可減輕低壓低氧所引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)

3 討論

研究[4]表明，根據(jù)暴露時(shí)間的長(zhǎng)短，高原低氧環(huán)境會(huì)對(duì)機(jī)體造成可逆或不可逆的影響。但是高原病的病理生理過(guò)程尚未明確，也未發(fā)現(xiàn)一些高原病的特異性生物學(xué)標(biāo)志物。本研究以BV2小膠質(zhì)細(xì)胞和HDAC3條件性敲除小鼠為研究對(duì)象，探究低壓低氧對(duì)腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響及小膠質(zhì)細(xì)胞HDAC3在其中的作用。

機(jī)體的各項(xiàng)生命活動(dòng)離不開(kāi)氧氣，機(jī)體的組織、細(xì)胞以各種方式感受外界氧氣濃度的變化，外界氧濃度的改變分為兩種，一種是局部改變例如腫瘤或局部損傷[11-12]，另一種是全身性改變，例如當(dāng)機(jī)體處于高原低壓低氧環(huán)境[13]。常氧狀態(tài)下HIFs上的α亞基的脯氨酸殘基被脯氨酰羥化酶羥化而快速降解。缺氧條件下，脯氨酰羥化酶會(huì)被抑制，HIFs蛋白表達(dá)顯著增多[14-16]。有研究[14]顯示暴露在嚴(yán)重缺氧環(huán)境下的大鼠腦內(nèi)HIF-1α的表達(dá)高于常氧組的大鼠，缺氧又可以引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，但進(jìn)行缺氧預(yù)適應(yīng)后不引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α的表達(dá)獨(dú)立于腦內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的存在。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)缺氧細(xì)胞模型的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HIFs蛋白表達(dá)量顯著增多，因此將低氧處理后細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)量升高作為細(xì)胞低氧模型構(gòu)建成功的標(biāo)志。氧化應(yīng)激在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中扮演著十分重要的角色，研究[17]表明在各種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中，神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中自由基代謝平衡嚴(yán)重失調(diào)，對(duì)于自由基的防御能力明顯下降，過(guò)量的自由基可使生物膜磷脂雙分子層中的不飽和脂肪酸過(guò)氧化，而形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，從而使組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生障礙。

實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)低壓低氧暴露引起小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)因子升高，這表明低壓低氧可以引起神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激反應(yīng)。在小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性地敲除HDAC3后，低壓低氧暴露引起小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)因子下調(diào)，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞中敲除HDAC3可以緩解低壓低氧所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。提示HDAC3參與了低壓低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。HDAC3屬于HDACs，是大腦中表達(dá)最廣泛的HDACs[18-19]。抑制HDAC3減少相關(guān)蛋白去乙酰化作用，可以抑制相關(guān)炎癥信號(hào)通路的激活，減輕缺血再灌注引起的腦損傷，有助于減輕神經(jīng)退行性疾病中的運(yùn)動(dòng)表型缺陷和轉(zhuǎn)錄失調(diào)[20]。本實(shí)驗(yàn)中，敲除小膠質(zhì)細(xì)胞中HDAC3后可減輕低壓低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能與HDAC3的去乙?；饔脤?dǎo)致轉(zhuǎn)錄受到抑制有關(guān)，HDAC3的特異性抑制劑可能成為高原腦損傷治療的有效藥物，還有待深入研究。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)伴隨著抗氧化能力的降低，例如SOD的下調(diào)[21]。但是也有研究[22-23]顯示神經(jīng)炎癥以及內(nèi)分泌疾病所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)中伴隨著SOD的上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中低壓低氧暴露后，ROS水平升高，這直接證明了氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。而B(niǎo)V2小膠質(zhì)細(xì)胞以及小鼠腦內(nèi)SOD顯著升高，造成這個(gè)差異的原因，一方面可能來(lái)自于氧化應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)時(shí)間的不同；另一方面還可能是由于超氧化物成分的相對(duì)比例不同。文獻(xiàn)[24]顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的增加促進(jìn)細(xì)胞核易位和細(xì)胞信號(hào)通路的激活促進(jìn)iNOS和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而進(jìn)一步延長(zhǎng)大腦氧化應(yīng)激和炎癥循環(huán)。但是本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)低壓低氧暴露后炎癥因子的顯著上調(diào)，導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象的原因可能在于小鼠相對(duì)于人類對(duì)于高原環(huán)境的抵抗能力更強(qiáng)，此外還可能由于小鼠低壓低氧處理的時(shí)間短、采樣過(guò)程中標(biāo)本復(fù)氧等原因，從而無(wú)法引起強(qiáng)烈的神經(jīng)炎癥的發(fā)生。

本研究揭示了暴露于低壓低氧環(huán)境中將導(dǎo)致腦組織及小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，抑制HDAC3則可以緩解該現(xiàn)象，進(jìn)一步豐富了HDAC3在缺氧相關(guān)疾病中的作用研究。在此基礎(chǔ)上，本課題組將繼續(xù)研究干預(yù)HDAC3是否可改善低壓低氧導(dǎo)致的認(rèn)知功能降低，從而為相關(guān)疾病的防治提供藥物靶點(diǎn)和理論依據(jù)。