劉漢雄， 楊小安， 熊潭瑋

(1.郴州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南省郴州市 423001；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染科，廣東省廣州市 510630)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC)主要來(lái)源于骨髓，并存在于肝臟、脾臟、心肌等多個(gè)組織器官中，可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管再生[1]。肝損傷時(shí)，骨髓來(lái)源的EPC能順利歸巢到受損肝組織[2]，而體外擴(kuò)增的EPC[3]經(jīng)肝門靜脈或外周靜脈輸入，也能到達(dá)受損肝組織。EPC到達(dá)受損肝組織后可分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和肝臟修復(fù)[4]。EPC還可以通過(guò)血管生成作用修復(fù)受損肝組織。Child-Pugh分級(jí)為目前臨床使用最廣泛的肝硬化及肝功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。但肝硬化患者循環(huán)EPC功能及與Child-Pugh評(píng)分關(guān)系的報(bào)道少見(jiàn)，本文對(duì)此進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院2019年1月—2020年1月住院或門診確診乙型肝炎肝硬化患者60例為肝硬化組，其中Child-Pugh A、B、C級(jí)[5]各20例；另選同期20例健康體檢者為對(duì)照組。乙型肝炎病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg陽(yáng)性或HBV-DNA陽(yáng)性。對(duì)照組研究對(duì)象排除乙型肝炎病毒感染(HBsAg陰性且HBV-DNA陰性)。兩組基線資料見(jiàn)表1。本研究由本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

表1 各組臨床資料的比較

1.2 循環(huán)EPC的分離、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

抽取靜脈外周血加入含F(xiàn)icoll-Paque人淋巴細(xì)胞分離液的離心管上層，4 ℃ 2 200 r/min離心25 min，吸取第二層云霧狀單核細(xì)胞層，將分離所得單個(gè)核細(xì)胞重懸于含有20%胎牛血清、50 μg/L血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的EGM-2培養(yǎng)基中，接種至預(yù)先包被好人纖維連接蛋白(1 ng/L)的6孔板中，置于5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液除去未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)至7天后的貼壁細(xì)胞即為實(shí)驗(yàn)所用EPC。本研究使用DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素-l(FITC-BS-l)雙重染色免疫熒光鑒定EPC，Dil-ac-LDL(紅色)和FITC-BS-Lectin(綠色)雙染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量即為EPC，計(jì)數(shù)EPC。

1.3 EPC增殖、遷移能力的測(cè)定

原代內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)7天后，用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，重懸于DMEM培養(yǎng)液中。將相同數(shù)量?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞接種到包被有人纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板，每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，培養(yǎng)4 h后棄去上清液，在酶標(biāo)儀下于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)OD值。調(diào)整細(xì)胞至2×105個(gè)/mL；置入Transwell小室，24 h后取出小室，棄去上層液體，刮去濾膜上的未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醇溶液固定10 min，以DAPI染色，置于熒光顯微鏡下觀察，選擇3個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)遷移入下室的細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 乙型肝炎肝硬化患者EPC數(shù)量的變化

內(nèi)皮祖細(xì)胞的熒光染色鑒定見(jiàn)圖1。循環(huán)EPC數(shù)量乙型肝炎肝硬化早期患者(Child-Pugh A、B級(jí))較對(duì)照組增加，且高于Child-Pugh C級(jí)患者(P<0.05)；Child-Pugh C級(jí)患者較對(duì)照組高但差異無(wú)顯著性(P>0.05；圖1)。

圖1 乙型肝炎肝硬化患者EPC鑒定和數(shù)量的變化熒光染色鑒定Dil-ac-LDL為紅色，Lectin為綠色，雙染色細(xì)胞即為EPC(200×)。a為P<0.05，與對(duì)照組和Child-Pugh C組比較；b為P<0.05，與Child-Pugh A組比較。

2.2 乙型肝炎肝硬化患者內(nèi)皮祖細(xì)胞功能變化

Child-Pugh A級(jí)、B級(jí)、C級(jí)患者循環(huán)EPC的體外遷移、增殖能力隨Child-Pugh分級(jí)升高而降低(P<0.05；表2)。

表2 乙型肝炎肝硬化患者內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的變化

2.3 循環(huán)EPC功能與Chhild評(píng)分的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，循環(huán)EPC遷移和增殖能力與Child-Pugh評(píng)分均呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05；圖2)。

圖2 乙型肝炎肝硬化患者循環(huán)EPC功能與Child-Pugh評(píng)分的相關(guān)性

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎肝硬化早期(Child-Pugh A、B級(jí))患者循環(huán)EPC數(shù)量較對(duì)照組上升，而晚期(Child-Pugh C級(jí))患者EPC數(shù)量較對(duì)照組輕微上升，較早期卻下降；EPC數(shù)量與Child-Pugh評(píng)分之間沒(méi)有相關(guān)性,而EPC遷移、增殖能力與Child-Pugh評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。因此推論，在肝硬化形成以后，隨著肝硬化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，肝小葉正常結(jié)構(gòu)破壞，肝臟微循環(huán)系統(tǒng)也受到損傷。這些變化都可能導(dǎo)致門脈高壓產(chǎn)生，引起血管內(nèi)皮損傷和微循環(huán)障礙。機(jī)體為修復(fù)受損的血管內(nèi)皮，加強(qiáng)從骨髓募集、動(dòng)員EPC，從而使循環(huán)EPC數(shù)量增加。該過(guò)程可能是機(jī)體修復(fù)肝損傷及肝纖維化的一種代償機(jī)制。而乙型肝炎肝硬化晚期患者已處于嚴(yán)重耗竭狀態(tài)，并發(fā)腹水、黃疸、肝性腦病等多種并發(fā)癥，骨髓功能亦受到影響，無(wú)法動(dòng)員足夠EPC修復(fù)肝臟，導(dǎo)致EPC水平較早期出現(xiàn)下降。這種下降趨勢(shì)，可能導(dǎo)致微循環(huán)障礙難以修復(fù)，與肝硬化的進(jìn)展相互促進(jìn)。

本結(jié)果還顯示，乙型肝炎肝硬化患者循環(huán)EPC功能呈下降趨勢(shì)，且隨著Child-Pugh評(píng)分上升EPC功能下降更為明顯。乙型肝炎肝硬化發(fā)生后，肝臟功能受到損傷，肝臟代謝功能和合成功能紊亂，導(dǎo)致膽紅素升高，脂質(zhì)代謝異常及各種有毒物質(zhì)蓄積，導(dǎo)致EPC功能出現(xiàn)障礙。同時(shí)，也可能是乙型肝炎肝硬化晚期EPC數(shù)量減少，EPC功能障礙，對(duì)肝臟血管內(nèi)皮修復(fù)及血管新生造成影響，從而進(jìn)一步促進(jìn)了肝硬化的進(jìn)展。

有研究與本研究結(jié)果一致，認(rèn)為肝硬化患者循環(huán)EPC功能降低[6]，EPC數(shù)量上升[7]。然而，也有研究認(rèn)為，肝硬化患者循環(huán)EPC數(shù)量下降[8-9]，EPC功能增強(qiáng)[10]。本研究認(rèn)為，不同結(jié)果可能與入組病例肝硬化的病因不一致，或者其他研究未對(duì)肝硬化嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)有關(guān)。不同原因肝硬化有不同發(fā)病機(jī)制，不同肝硬化嚴(yán)重程度患者的肝功能水平不同，并發(fā)癥不同，導(dǎo)致EPC募集、動(dòng)員能力及功能必定也會(huì)出現(xiàn)改變。本研究入組患者均為乙型肝炎肝硬化患者，且按照國(guó)際公認(rèn)的Child-Pugh分級(jí)進(jìn)行研究，從而減少了研究偏倚。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者循環(huán)EPC數(shù)量上升，EPC功能降低。以EPC為治療靶點(diǎn)，提高其數(shù)量及功能，有可能達(dá)到修復(fù)肝損傷及阻止肝硬化惡化的目的。以EPC為靶點(diǎn)的乙型肝炎肝硬化治療策略，如EPC移植，應(yīng)該得到重視及進(jìn)一步的研究。