王裕紅

(瓊海市中醫(yī)院藥劑科，海南省瓊海市 571400)

奧氮平是一線抗精神疾病用藥，其引起的肥胖及糖脂代謝紊亂問題日益突出[1-2]。目前網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有多成分、多靶點網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用，而中藥單體作為中草藥的活性成分，因具有多種藥用特性成為新藥開發(fā)的重要來源[3]。葛根素是中藥葛根的活性成分，有抗氧化、退熱、鎮(zhèn)靜及降脂降糖等作用[4]。既往雖有研究證實葛根素具有調(diào)節(jié)糖脂代謝作用，但相關(guān)機制研究并未深入。本研究主要探討葛根素對奧氮平誘導(dǎo)的大鼠糖脂代謝紊亂模型的影響及對細(xì)胞信號代謝通路——沉默調(diào)節(jié)蛋白3(recombinant sirtuin 3，Sirt3)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由中國食品藥品檢定研究院提供，許可證號：SCXK(京)2019-0017。飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，相對濕度(50±10)%，滅菌普通飼料喂養(yǎng)。動物實驗參照3R原則。

1.2 試劑和儀器

葛根素(江蘇恩鳴生物工程科技有限公司，純度為98%)，奧氮平(江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司)；二甲雙胍腸溶片(北京利齡恒泰藥業(yè)有限公司)，3-TYP(Sirt3抑制劑，上海源葉生物科技有限公司，純度為98%)。

BCA蛋白試劑盒、蛋白抽提RIPA裂解液、上樣緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)，Sirt3、AMPKα、磷酸化AMPK(p-AMPK)、ACC和p-ACC一抗、β-actin(Abcam中國)，HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(美國CST公司)。血糖試紙(美國強生公司)、石蠟切片機(德國徠卡公司)，高速冷凍離心機(美國Sigma公司)。

1.3 糖脂代謝紊亂模型建立及分組方法[5-6]

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為對照組、3-TYP組、模型組、葛根素組、葛根素+3-TYP組和陽性藥物組，10只/組。除對照組和3-TYP組外，各組均以奧氮平2.5 mg/kg灌胃，2次/天，連續(xù)4天，第5天起調(diào)整劑量為12.5 mg/kg，2次/天，對照組和3-TYP組則以等量生理鹽水灌胃。第15天起葛根素組以葛根素每天400 mg/kg灌胃；3-TYP組以每天3-TYP 50 mg/kg灌胃；葛根素+3-TYP組在葛根素組基礎(chǔ)上以每天3-TYP 50 mg/kg灌胃；陽性藥物組以二甲雙胍腸溶片0.2 g/kg灌胃，2次/天；對照組和模型組則以生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)56天，實驗期間自由進(jìn)食飲水。

1.4 稱量法檢測Lee’s指數(shù)及FBG檢測

于末次給藥后第2天檢測各組體質(zhì)量及空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，測量各組大鼠體質(zhì)量(電子天平測量)及體長(鼻至肛門長度)，計算Lee’s指數(shù)[Lee’s指數(shù)=(體質(zhì)量/體長)1/3]。FBG檢測前禁食、禁水8 h，尾尖采血，血糖儀檢測FBG。

1.5 酶法檢測血脂指標(biāo)

FBG檢測后大鼠以1%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于操作臺面，取腹主動脈血，置于EDTA抗凝試管中，離心分離血漿，檢測量總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipid-cholesterol，HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipid-cholesterol，LDLC)。

1.6 稱量法檢測脂肪濕重并計算脂肪系數(shù)

取血后，分離大鼠肝臟、心臟、腎臟(內(nèi)臟脂肪)與腹股溝脂肪組織(皮下脂肪)，稱重，計算脂肪濕重和脂肪系數(shù)。脂肪系數(shù)(%)=脂肪濕重/體質(zhì)量×100%。

1.7 Western blotting法檢測脂肪組織Sirt3/AMPK信號通路蛋白表達(dá)

取大鼠脂肪組織，加入裂解液裂解，冰上靜置10 min，離心取上層，加入2×上樣緩沖液，水浴加熱5 min蛋白變性，以BCA試劑盒測量蛋白水平，SDS-PAGE法分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入一抗，4 ℃封閉過夜，加入二抗，室溫下孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影、定影，拍照，以Quantity One圖像分析軟件分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

以SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Lee’s指數(shù)及FBG比較

與對照組比較，3-TYP組Lee’s指數(shù)和FBG均升高(P<0.05)；與3-TYP組比較，模型組Lee’s指數(shù)和FBG均升高(P<0.05)；與模型組比較，葛根素組Lee’s指數(shù)和FBG均降低(P<0.05)；與葛根素組比較，葛根素+3-TYP組Lee’s指數(shù)和FBG均升高(P<0.05)；與葛根素+3-TYP組比較，陽性藥物組的Lee’s指數(shù)和FBG降低(P<0.05；表1)。

表1 各組大鼠Lee’s指數(shù)及FBG比較(n=10)

2.2 各組大鼠血脂指標(biāo)比較

與對照組比較，3-TYP組TC、TG、LDLC均升高，HDLC均降低(P<0.05)；與3-TYP組比較，模型組TC、TG、LDLC均升高，HDLC均降低(P<0.05)；與模型組比較，葛根素組TC、TG、LDLC均降低，HDLC均升高(P<0.05)；與葛根素組比較，葛根素+3-TYP組TC、TG、LDLC均升高，HDLC均降低(P<0.05)；與葛根素+3-TYP組比較，陽性藥物組TC、TG、LDLC均降低，HDLC均升高(P<0.05;表2)。

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)比較(n=10) 單位：mmol/L

2.3 各組大鼠脂肪濕重及脂肪系數(shù)比較

與對照組比較，3-TYP組脂肪濕重與脂肪系數(shù)均升高(P<0.05)；與3-TYP組比較，模型組脂肪濕重與脂肪系數(shù)均升高(P<0.05)；與模型組比較，葛根素組脂肪濕重與脂肪系數(shù)均降低(P<0.05)；與葛根素組比較，葛根素+3-TYP組脂肪濕重與脂肪系數(shù)均升高(P<0.05)；與葛根素+3-TYP組比較，陽性藥物組脂肪濕重與脂肪系數(shù)均降低(P<0.05；表3)。

表3 各組大鼠肪濕重及脂肪系數(shù)比較(n=10)

2.4 各組大鼠脂肪組織Sirt3/AMPK信號通路蛋白表達(dá)比較

與對照組比較，3-TYP組Sirt3蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均降低(P<0.05)；與3-TYP組比較，模型組Sirt3蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均升高(P<0.05)；與模型組比較，葛根素組Sirt3蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均升高(P<0.05)；與葛根素組比較，葛根素+3-TYP組Sirt3蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均降低(P<0.05)；與葛根素+3-TYP組比較，陽性藥物組Sirt3蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均升高(P<0.05；圖1和圖2)。

圖1 大鼠脂肪組織Sirt3/AMPK信號通路蛋白Western blotting圖A為對照組；B為3-TYP組；C為模型組；D為葛根素組；E為葛根素+3-TYP組；F為陽性藥物組。

圖2 各組大鼠脂肪組織Sirt3蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC比較a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與3-TYP組比較；c為P<0.05，與模型組比較；d為P<0.05，與葛根素組比較；e為P<0.05，與葛根素+3-TYP組比較。

3 討 論

研究證實，精神疾病患者治療期間出現(xiàn)的體質(zhì)量增加、糖尿病及TG的升高與第2代抗精神疾病藥物的使用有關(guān)，并能進(jìn)一步增加精神疾病患者心腦血管疾病患病風(fēng)險，影響抗精神疾病治療的依從性及轉(zhuǎn)歸[7-8]。因此及時處理抗精神疾病藥物導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂對于患者的轉(zhuǎn)歸有重要意義。

葛根素是從中藥葛根中分離出的異黃酮類衍生物，具有免疫保護、抗氧化、改善微循環(huán)、擴張血管、抗癌等多種作用[9]。研究表明，葛根素能改善動脈粥樣硬化大鼠血脂異常，發(fā)揮降脂、抗炎的作用，并可改善糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞功能，有一定的降糖作用[10-11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)3-TYP干預(yù)后，大鼠Lee’s指數(shù)、FBG、TC、TG、LDLC、HDLC、脂肪濕重與脂肪系數(shù)等指標(biāo)與對照組差異存在顯著性，說明抑制Sirt3的表達(dá)可影響大鼠糖脂代謝；經(jīng)葛根素干預(yù)后上述代謝指標(biāo)得到改善，且聯(lián)合3-TYP干預(yù)對代謝指標(biāo)的改善作用減弱提示葛根素可改善奧氮平所致的大鼠糖脂代謝紊亂狀態(tài)，抑制Sirt3能降低葛根素對糖脂代謝紊亂的改善作用。

Sirt3/是作用于細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的信號通路，在肥胖及其他代謝疾病的研究中日益受到重視。Sirt3是一種依賴煙酰胺二核糖核苷的去乙?；?，具有調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激、能量代謝、凋亡等病理生理過程的作用[12-13]。AMPK是細(xì)胞的能量調(diào)節(jié)器，能在蘇氨酸172位點發(fā)生磷酸化激活調(diào)節(jié)糖脂代謝[14]。ACC是AMPK重要的下游分子，存在于各類合成脂類的組織和發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的線粒體中，在脂肪酸的代謝過程中有重要作用[15]。研究證實[16]，活化的AMPK可通過磷酸化下游ACC，抑制其活性，在細(xì)胞層面和整體層面調(diào)控機體能量平衡。本研究結(jié)果中顯示，經(jīng)葛根素干預(yù)后的大鼠Sirt3蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均升高，聯(lián)合3-TYP干預(yù)后Sirt3蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC升高水平下降。說明Sirt3/AMPK信號通路參與奧氮平引起的糖脂代謝紊亂的發(fā)生，而葛根素可增加Sirt3蛋白表達(dá)，提高AMPK、ACC的磷酸化活性。

綜上所述，葛根素可改善奧氮平誘導(dǎo)的大鼠糖脂代謝紊亂，其機制可能與激活Sirt3蛋白表達(dá)，提高AMPK、ACC的磷酸化活性有關(guān)。