王娟， 顧順忠， 陸洋， 顏永進(jìn)

(海安市人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇省海安市 226600)

冠心病的主要發(fā)病原因是冠狀動(dòng)脈堵塞和栓塞導(dǎo)致心肌缺血缺氧性壞死，炎癥在心肌缺血損傷的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[1]。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是一個(gè)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要因子，參與機(jī)體的各種生理過程[2]。信號(hào)誘導(dǎo)的泛素化及隨后NF-κB抑制劑(inhibitor of NF-κB,IκB)的降解是通過IκB激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)的激活啟動(dòng)的[3]。一旦IκB降解，NF-κB復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，以調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)[4]。依達(dá)拉奉是一種腦保護(hù)劑，能夠強(qiáng)效清除體內(nèi)的自由基及抑制脂質(zhì)過氧化，抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。目前依達(dá)拉奉在心肌損傷中的研究主要聚焦于抗氧化作用，而關(guān)于抗炎作用暫不清楚。因此，本研究著重于探究依達(dá)拉奉在心肌缺血損傷中的作用及機(jī)制研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和動(dòng)物

依達(dá)拉奉購自美國Sigma公司。蘇木精和伊紅購自索萊寶公司；組織細(xì)胞凋亡試劑盒(TUNEL)購自凱基公司；廣譜蛋白酶、磷酸酶抑制劑混合物和BCA試劑盒組織裂解液購自碧云天公司；p-IKKα/β、p-p65、p65抗體及β肌動(dòng)蛋白(β-actin)購自Abcam公司；熒光二抗購自奧德賽公司。無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(220±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(京)2012-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)、使用和操作均按照本單位倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)程序執(zhí)行。

1.2 心肌梗死模型的建立

采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和依達(dá)拉奉組，每組8只。異氟烷麻醉大鼠后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌損傷模型，具體步驟見文獻(xiàn)[6]。假手術(shù)組不結(jié)扎。所有大鼠術(shù)后給與抗生素預(yù)防感染，并用胸導(dǎo)聯(lián)檢測是否有ST段弓背向上型抬高。依達(dá)拉奉組術(shù)后1 h內(nèi)尾靜脈給與依達(dá)拉奉3 mg/kg，連續(xù)14天；模型組給與等量生理鹽水。假手術(shù)組不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1.3 超聲心動(dòng)圖測量

所有大鼠麻醉后仰臥位固定，取左側(cè)胸骨旁短軸切面，用小動(dòng)物超聲儀收集超聲心動(dòng)圖數(shù)據(jù)，并檢測左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricle shortens fraction,FS)、左心室后壁舒張期末厚度(end diastolic thickness of left ventricular posterior wall，LVPWd)。所有測量和分析都采取雙盲法，由經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲科技術(shù)人員進(jìn)行。

1.4 心肌組織炎癥因子的檢測

收集大鼠心臟組織，液氮冷凍后研磨成粉，然后加入RIPA裂解液裂解0.5 h，離心后吸取上清液。采用ELISA試劑盒(美國Invitrogen公司)檢測心肌組織炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。

1.5 免疫蛋白印跡法

取心臟組織，提取總蛋白。取20 μg蛋白樣品加入4%～20%預(yù)制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜。將醋酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，然后加入一抗P-IKKα/β、p-p65(1∶300)、p65(1∶500)與β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。次日，用TBST充分洗膜3次，每次5 min，然后用血清稀釋的免疫熒光二抗(1∶5 000)孵育，洗膜后用Odyssey曝光儀掃描，然后用Image J分析灰度值，所有目的蛋白都用β-actin做標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.6 心肌梗死面積評(píng)估

心臟組織經(jīng)多聚甲醛固定后，進(jìn)行石蠟切片，切片厚度5 μm。將切片置于0.2%氯化硝基四氮唑藍(lán)液(NBT)溶液室溫孵育3 min，再用福爾馬林浸泡，封片拍照。心肌梗死區(qū)未著色，心肌梗死面積比為梗死面積占整個(gè)心臟截面的百分比。

1.7 心肌細(xì)胞凋亡檢測

取大鼠心臟切片，切片厚度5 μm。脫蠟清洗后采用原位細(xì)胞凋亡試劑盒TUNEL染色。先加入0.5%Triton X-100處理10 min，再加入TUNEL反應(yīng)混合物37 ℃孵箱中孵育30 min。最后加入1 mg/L細(xì)胞核染色劑室溫孵育3 min。使用激光掃描共焦顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)TNUEL陽性細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組超聲心動(dòng)圖結(jié)果的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVPWd增加(P<0.05)，LVEF及FS降低(P<0.05)；與模型組比較，依達(dá)拉奉組LVPWd降低(P<0.05)，而LVEF、FS增加(P<0.05；表1)，表明依達(dá)拉奉組較模型組大鼠心功能顯著改善。

表1 各組超聲心動(dòng)圖結(jié)果的比較(n=8)

2.2 各組大鼠心肌組織炎癥因子水平的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，依達(dá)拉奉組IL-1β、IL-6及TNF-α水平降低(P<0.05；圖1)。

圖1 各組大鼠心肌組織炎癥因子水平的比較a為P<0.05，與假手術(shù)組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況的比較

與假手術(shù)組比較，模型組凋亡心肌細(xì)胞率上升(P<0.05)；與模型組比較，依達(dá)拉奉組凋亡心肌細(xì)胞率降低(P<0.05；圖2)。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況的比較(TUNEL染色，20×)a為P<0.05，與假手術(shù)組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.4 各組大鼠心肌梗死面積的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增大；與模型組比較，依達(dá)拉奉組心肌梗死面積顯著降低(P<0.05；圖3)。

圖3 各組大鼠心肌梗死面積的比較(NBT染色)未著色區(qū)域?yàn)樾募」Ｋ绤^(qū)域。a為P<0.05，與假手術(shù)組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.5 各組大鼠NF-κB信號(hào)通路的比較

與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織P-IKKα/β、p-p65、p65水平顯著升高，而依達(dá)拉奉組P-IKKα/β、p-p65、p65水平低于模型組(P<0.05；圖4)。

圖4 各組大鼠NF-κB信號(hào)通路的比較a為P<0.05，與假手術(shù)組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

心肌缺血缺氧損傷是冠心病的重要臨床特征，也是目前心血管領(lǐng)域引起患者死亡的重要原因[1]。心肌缺血損傷引起心肌細(xì)胞壞死、氧化應(yīng)激、炎癥風(fēng)暴等病理過程，最終導(dǎo)致心力衰竭[2,7-8]。因此，靶向于心肌缺血損傷是治療冠心病的重要臨床干預(yù)策略[9]。

本研究探討了依達(dá)拉奉對(duì)心肌損傷的改善作用，通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌缺血損傷模型，再給與依達(dá)拉奉干預(yù)。超聲結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVPWd顯著增加，而LVEF及FS顯著降低，表明心肌梗死模型成功建立；與模型組比較，依達(dá)拉奉組LVPWd顯著降低，而LVEF、FS顯著增加，提示依達(dá)拉奉對(duì)大鼠心肌損傷后心功能有一定改善作用。心功能改善是基于病理的改變，進(jìn)一步通過NBT染色觀察了心肌組織的病理改變。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增多；與模型組比較，依達(dá)拉奉組心肌梗死面積顯著降低。此外，心肌細(xì)胞凋亡在心肌缺血損傷后與疾病的預(yù)后密切相關(guān)。心肌缺血后，心肌細(xì)胞啟動(dòng)程序性細(xì)胞凋亡，形成凋亡小體，然后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活化介導(dǎo)心肌細(xì)胞的死亡。心肌細(xì)胞的凋亡也是決定心肌損傷是否轉(zhuǎn)向心力衰竭的重要因素。本研究通過TUNEL染色觀察了心肌損傷依達(dá)拉奉治療后心肌細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉能顯著改善心肌損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

依達(dá)拉奉是一種強(qiáng)效的氧自由基清除劑，臨床常用于治療腦卒中，并獲得了較好的臨床效果[10]。依達(dá)拉奉在急性心肌缺血缺氧中的作用尚不完全明確。近年來的研究提示依達(dá)拉奉也具有顯著的抗炎作用，目前已經(jīng)在神經(jīng)退行性疾病中得到驗(yàn)證[11]。過度的炎癥反應(yīng)，包括炎癥因子風(fēng)暴、單核巨噬細(xì)胞的激活是加重心肌缺血損傷的重要因素。因此，本研究探究了依達(dá)拉奉是否能夠抑制心肌缺血損傷后的炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示，心肌缺血損傷組大鼠心肌組織的炎癥因子水平顯著升高，依達(dá)拉奉干預(yù)后炎癥因子水平顯著降低，提示依達(dá)拉奉具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。炎癥反應(yīng)是由多種信號(hào)通路共同調(diào)控的，其中NF-κB是一個(gè)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要分子，細(xì)胞質(zhì)IκB降解后，NF-κB復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而發(fā)揮基因調(diào)控功能。本研究發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉能夠顯著抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，從而降低了NF-κB信號(hào)通路調(diào)控的炎癥反應(yīng)激活。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能夠通過抑制NF-κB通路改善心肌缺血損傷和炎癥反應(yīng)。