耿楊柳， 冉鵬寧， 徐 香

(國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北省十堰市 442000)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是育齡期婦女的常見(jiàn)病和多發(fā)病，臨床表現(xiàn)為不孕、盆腔痛及痛經(jīng)等，EM的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床治療手段有限，且具有較高的復(fù)發(fā)率和惡變率[1]。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞能夠隨血液逆流進(jìn)入盆腔并在異位種植形成病灶，提示子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可能與EM的發(fā)病過(guò)程有關(guān)[2]。Wnt/β-catenin通路是常見(jiàn)的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖的信號(hào)通路，參與了多種子宮內(nèi)膜疾病的病理過(guò)程[3]。本研究分析Wnt/β-catenin通路抑制劑Wnt-C59對(duì)EM子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖的作用，為相關(guān)臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

子宮內(nèi)膜組織來(lái)自于本院2017年7月—2018年7月因子宮肌瘤或者EM子宮切除患者，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞參考文獻(xiàn)[4]由本實(shí)驗(yàn)室分離純化獲得。Wnt3a一抗(武漢艾美捷科技有限公司)；β-catenin一抗(北京百奧萊博科技有限公司)；Caspase-3一抗(R&D公司)；Caspase-9一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；二抗及顯色試劑盒(Santa Cruz公司)；無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；膠原酶(Sigma Aldrich公司)；脫色搖床及轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)；垂直電泳儀、凝膠成像儀(美國(guó)Bio Rad公司)；離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。其余試劑均為市售分析純。LC3檢測(cè)試劑盒(R&D公司)；Beclin1檢測(cè)試劑盒(Abcam公司)；多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200，瑞士)。

1.2 MTT法

將子宮內(nèi)膜干細(xì)胞接種至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=5)、低劑量組(5 mmol/L Wnt-C59，n=5)和高劑量組(30 mmol/L Wnt-C59，n=5)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣品。對(duì)照組給予生理鹽水處理4 h，其余各組給予對(duì)應(yīng)劑量Wnt-C59處理4 h。每孔加入20 mL MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)樣品的3個(gè)平行樣品分別于1、2、4 h后終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)上清液，采用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液沖洗后加入150 mL二甲基亞砜，振蕩處理10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)后各培養(yǎng)孔的光密度值，并計(jì)算抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組OD490-試驗(yàn)組OD490)/對(duì)照組OD490×100%。

1.3 Western blotting

各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理后，提取細(xì)胞總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量。以等量總蛋白與5×SDS上樣緩沖液煮沸10 min后進(jìn)行垂直SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜(320 mA/80 min)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上。轉(zhuǎn)膜后用5.0%脫脂牛奶封閉1 h，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液沖洗3次。將封閉后的纖維素薄膜與一抗(1∶200)在4 ℃條件下孵育4 h，無(wú)菌PBS漂洗后加入二抗(1∶4 000)孵育2 h后進(jìn)行顯色。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行Wnt3a、β-catenin、Caspase-3和Caspase-9蛋白水平的相對(duì)定量分析。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

吸取培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，加入膠原酶，吹打后室溫放置5 min充分裂解。將懸液收集至離心管中，1 500 r/min離心10 min后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，-80 ℃和室溫反復(fù)凍融數(shù)次后待測(cè)。采用包被稀釋液稀釋樣品，5.0%脫脂牛奶封閉酶標(biāo)儀反應(yīng)孔1 h，吸取100 mL樣本于酶標(biāo)儀反應(yīng)孔中，加入酶標(biāo)抗體后充分反應(yīng)45 min，加入底物液室溫避光放置5 min后加入終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)OD450處光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 Wnt-C59對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖的影響

Wnt-C59處理1、2和4 h后，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且高劑量組抑制效果明顯高于低劑量組(P<0.05；表1)。

表1 Wnt-C59對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖抑制率的影響 單位：%

2.2 Wnt-C59對(duì)Wnt3a及β-catenin蛋白水平的影響

Wnt-C59處理后，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞Wnt3a及β-catenin蛋白水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，高劑量組較低劑量組更為顯著(P<0.05；圖1)。

圖1 Wnt-C59對(duì)Wnt3a及β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響

2.3 Wnt3a及β-catenin蛋白與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖抑制率的相關(guān)性

Wnt-C59處理后，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞Wnt3a及β-catenin蛋白水平均與Wnt-C59處理4 h后子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖的抑制率呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05；圖2)。

圖2 Wnt3a及β-catenin蛋白與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖抑制率的相關(guān)性

2.4 Wnt-C59對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞凋亡蛋白水平的影響

Wnt-C59處理后，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的水平較對(duì)照組升高(P<0.05)，高劑量組較低劑量組差異有顯著性(P<0.05；圖3)。

圖3 Wnt-C59對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞Caspase-3及Caspase-9蛋白水平的影響

2.5 Wnt-C59對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平的影響

Wnt-C59處理后，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞LC3、Beclin1蛋白水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，高劑量組較低劑量組更為顯著(P<0.05；表2)。

表2 Wnt-C59對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平的影響 單位：μg/L

3 討 論

EM指具有增殖活性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞種植在子宮內(nèi)膜之外的位置，形成異位子宮內(nèi)膜組織的增生性疾病。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞學(xué)說(shuō)是近年來(lái)出現(xiàn)的解釋EM發(fā)病機(jī)理的學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為子宮內(nèi)膜的高度再生能力與成體干細(xì)胞密切相關(guān)，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞作為一種成體干細(xì)胞，具有無(wú)限增殖潛能、自我更新和分化能力，可引發(fā)EM、子宮內(nèi)膜增生及子宮內(nèi)膜癌等一系列子宮內(nèi)膜增生性病變[5-6]。其中，EM的發(fā)病是由于子宮內(nèi)膜干細(xì)胞沿著血液逆流進(jìn)入盆腔內(nèi)并進(jìn)行增殖、分化。Wnt/β-catenin信號(hào)通路常見(jiàn)于各種細(xì)胞中，與細(xì)胞的增殖、分化作用密切相關(guān)[7-8]。本研究采用Wnt/β-catenin通路抑制劑Wnt-C59處理體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，分析處理后子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖作用與Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白Wnt3a及β-catenin水平的相關(guān)性，及對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞凋亡作用及自噬作用的影響。

Wnt/β-catenin通路是一種調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖的信號(hào)通路，Wnt與β-catenin是Wnt/β-catenin通路分子作用機(jī)制中重要的蛋白。Wnt可通過(guò)與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，抑制胞質(zhì)內(nèi)蛋白酶對(duì)β-catenin的磷酸化修飾、泛素化修飾及降解作用，促使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)聚集，并進(jìn)入到細(xì)胞核中與轉(zhuǎn)錄子發(fā)生相互作用，促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄[9]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Wnt-C59處理后子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，高劑量組的抑制效果明顯高于低劑量組；子宮內(nèi)膜干細(xì)胞Wnt3a及β-catenin蛋白的表達(dá)明顯降低，高劑量組降低比低劑量組更顯著。本研究Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的增殖抑制率與Wnt3a及β-catenin水平均呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，表明Wnt/β-catenin通路抑制劑Wnt-C59能有效抑制EM子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白Wnt3a及β-catenin的水平，且Wnt-C59對(duì)EM子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖的抑制作用可能與其對(duì)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的抑制有關(guān)。分析其原因在于，Wnt-C59可通過(guò)抑制Porcupine酶活性，從而抑制Porcupine酶介導(dǎo)的Wnt蛋白棕櫚?；揎椷^(guò)程，減少Wnt蛋白的合成分泌，進(jìn)而使得Wnt蛋白對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞胞內(nèi)蛋白磷酸化酶、泛素化酶的調(diào)控作用減弱，β-catenin蛋白在胞質(zhì)內(nèi)泛酸化酶等的作用下泛素化并降解，β-catenin蛋白水平下降，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用減弱，從而起到抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖的作用[10]。

細(xì)胞的凋亡作用、自噬作用與增生性病變的發(fā)病、病情進(jìn)展密切相關(guān)。研究表明，細(xì)胞的凋亡作用和自噬作用在細(xì)胞增殖、細(xì)胞修復(fù)及機(jī)體對(duì)增生病變細(xì)胞的清除中發(fā)揮著重要作用[11-12]。本研究進(jìn)一步研究了Wnt/β-catenin通路抑制劑Wnt-C59對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白、自噬相關(guān)蛋白水平的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)Wnt-C59處理后子宮內(nèi)膜干細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9的水平明顯升高，高劑量組顯著高于低劑量組。而經(jīng)Wnt-C59處理后子宮內(nèi)膜干細(xì)胞中LC3、Beclin1水平明顯升高，高劑量組顯著高于低劑量組。其中Caspase-3、Caspase-9均是直接參與細(xì)胞凋亡作用的蛋白，Beclin1是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，LC3是伴隨自噬作用產(chǎn)生的自噬標(biāo)志物[13-14]。Wnt-C59可促進(jìn)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的凋亡及自噬，分析其原因在于，一方面Wnt-C59通過(guò)降低胞內(nèi)β-catenin水平，可能降低了凋亡抑制因子Survivin的表達(dá)，下調(diào)了對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制，進(jìn)而起到對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；另一方面Wnt/β-catenin通路與調(diào)控細(xì)胞自噬的TSC/mTOR信號(hào)通路密切相關(guān)，Wnt-C59可通過(guò)下調(diào)Wnt水平，抑制TSC相關(guān)復(fù)合物的形成，增加mTOR的降解，從而下調(diào)對(duì)細(xì)胞自噬的抑制作用，起到促進(jìn)細(xì)胞自噬的作用[15-16]。

綜上所述，Wnt/β-catenin通路抑制劑Wnt-C59能有效抑制EM子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖，促進(jìn)EM子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的凋亡、自噬作用，其作用可能與其對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制有關(guān)。