許 超，何承剛，姜 華

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 云南 昆明 650201；2. 云南省林業(yè)和草原科學(xué)院, 云南 昆明 650201）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是豆科(Leguminosae)多年生草本植物，堪稱“牧草之王”，既是我國草地農(nóng)業(yè)的主要作物，也是生態(tài)治理的重要草種，更是畜牧業(yè)賴以發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。云南省自20 世紀80 年代進行了紫花苜蓿的引種工作，截止目前很多地方逸散了紫花苜蓿，其中部分逸散紫花苜蓿經(jīng)過長期的適應(yīng)，逐漸成為當(dāng)?shù)貎?yōu)勢種群并被研究利用[3]。云南省立體氣候顯著，特別是金沙江干熱河谷區(qū)氣候特征獨特，由于生態(tài)環(huán)境惡劣，優(yōu)質(zhì)豆科牧草極為缺乏。而此前在云南省迪慶州奔子欄鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)的成群落分布的逸散紫花苜蓿，表現(xiàn)出了較強的耐干熱性，是當(dāng)?shù)剌^為重要的紫花苜蓿資源。

隨著全球氣候的進一步變暖，干旱的趨勢進一步延續(xù)，植物的抗干熱能力便成為農(nóng)業(yè)研究中的重要問題。植物在高溫、干旱和強光等逆境下都會產(chǎn)生光抑制，同時在進化過程中也形成了多種保護機制[4]，其中依賴于葉黃素循環(huán)(xanthophyll cycle)的熱耗散作用近年不斷受到學(xué)者關(guān)注，其在耗散過剩的激發(fā)能中起著重要作用，被認為是光保護的主要途徑[5-6]。在紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(violaxanthindeepoxidase, VDE)的催化下，紫黃質(zhì)(violaxanthin)經(jīng)中間產(chǎn)物環(huán)氧玉米黃質(zhì)(antheraxanthin)轉(zhuǎn)變成玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)[7]，逆境條件下，如果植物形成的同化力未被碳同化過程完全消耗掉，就會使類囊體腔內(nèi)的pH 降低，激活葉黃素循環(huán)，類囊體膜中的V、A、Z 色素通過葉黃素循環(huán)相互轉(zhuǎn)化，與PSⅡ的捕光復(fù)合物(light-harvesting complex of PSⅡ, LHCII)相結(jié)合，通過V 和Z 對植物主要光合天線復(fù)合體LHCII的分子結(jié)構(gòu)的影響，使構(gòu)象發(fā)生變化，散發(fā)過量光能[8-9]。Gerganova 等[10]在對西紅柿(Lycopersicon esculentum)的研究中提出葉黃素循環(huán)可能在高溫和高光聯(lián)合作用中有重要作用。葡萄(Vitis vinifera)葉片光合器官損害機制的研究表明，葉黃素環(huán)是響應(yīng)臭氧脅迫的保護機制之一[11]。前期試驗發(fā)現(xiàn)干熱脅迫下紫花苜?？赡芡ㄟ^葉黃素循環(huán)進行熱耗散，是光保護的重要途徑之一[4]。而VDE基因是類胡蘿卜素生物合成途徑中葉黃素循環(huán)脫環(huán)氧化過程的關(guān)鍵基因，能保護光合器官不受損害[12]。已有學(xué)者從多種植物中克隆了VDE序列，比如小麥[13](Triticum aestivum)、茶樹[14](Camellia sinensis)、姜[15](Zingiberofficinale)、西紅柿[16](Lycopersicon esculentum)、咖啡樹[17](Coffea arabica)、黃瓜[18](Cucumis sativus)、煙草[19](Nicotiana tabacum)、毛竹[20](Phyllostachys edulis)、枸杞[21](Lycium chinense)、玉米[22](Zea mays)、草莓[23](Fragaria ananassa)、歐李[24](Cerasus humilis)等。但Bugos 和Yamamoto [25]將萵苣(Lactuca sativa)中的VDE基因分離克隆，進行原核表達，發(fā)現(xiàn)VDE 蛋白會受到二硫蘇糖醇(1, 4-Dithiothreitol, DTT)的專一抑制。高文蕊等[26]通過對外施DTT 溶液，發(fā)現(xiàn)干旱條件下隨著處理時間的延長，歐李的熱耗散能力降低并發(fā)生了光抑制現(xiàn)象。徐凱等[27]提出在強光脅迫下，草莓葉片的葉黃素循環(huán)可能受到DTT 溶液的抑制而影響了熱耗散能力。

目前，研究葉黃素循環(huán)關(guān)鍵基因之一的VDE基因是從分子層面研究光保護的切入點，備受學(xué)者關(guān)注。非生物脅迫下植株通過葉黃素循環(huán)進行光保護的研究多在水果、作物或模式植物中有報道。但關(guān)于紫花苜蓿的光抑制和光保護機制的研究鮮有報道。本研究利用RACE 技術(shù)克隆云南省典型干熱河谷區(qū)的逸散紫花苜蓿MsVDE基因全長cDNA，對該基因進行蛋白結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測分析，同時通過實時定量PCR 分析MsVDE基因在干熱脅迫下的響應(yīng)，為解析云南逸散紫花苜蓿特異耐干熱性提供可行的路徑。

1 材料與方法

1.1 植物材料與主要試劑

云南逸散紫花苜蓿種子采自云南省迪慶州德欽縣東南部的奔子欄鎮(zhèn)干熱河谷地區(qū)，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)實驗室提供。將供試種子用0.1% HgCl2消毒30 min，然后將消毒的種子置于人工氣候箱中催芽，將發(fā)芽的種子種在10 cm × 10 cm 的花盆中(介質(zhì)為腐殖土 ： 紅土 ： 蛭石 = 2 ： 1 ： 1)，置于溫室，每4 d 澆灌一次50%的Hoagland 營養(yǎng)液，期間澆一次清水，直到植株長到10 cm 高，選擇長勢一致的幼苗，將其移栽到20 cm × 20 cm 的花盆中，每盆20 株。然后將生長100 d 的植株，隨機選取長勢一致的供試材料，按試驗設(shè)計進行處理。

RNA 提取試劑盒(北京華越洋公司)、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV reverse transcriptase)、柱式DNA膠回收試劑盒(B518131)、RACE 試劑盒(Invitrogen公司)、pMD18-T 載體大腸桿菌DH5α 等由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，LA Taq 和Super ScriptTMII 逆轉(zhuǎn)錄酶由大連寶生物公司提供，二硫蘇糖醇(DTT)產(chǎn)自BBI Life Sciences 公司。其余常規(guī)藥品為國產(chǎn)分析純或進口分析純。

1.2 試驗設(shè)計與處理

處理前將盆栽試驗材料一次性澆足水(盆底有水流出)，放置14 h 后測定各盆內(nèi)的土壤相對含水量，均在31%～32%。再用DTT 溶液(參照歐李幼苗[24]、草莓葉片[23]DTT 的處理濃度，5 mmo1·L?1)噴灑紫花苜蓿的葉片，以噴灑去離子水(deionized water,ddH2O)作為對照。選用兩個人工氣候箱，一個設(shè)定為正常條件(對照)：空氣濕度為75%，溫度恒溫22 ℃，白天14 h，夜間10 h；另一個設(shè)置為干熱脅迫條件：空氣濕度為30%，白天(14 h)溫度為32 ℃，夜間(10 h)溫度為28 ℃。將噴灑了DTT 溶液和去離子水的材料同時放入兩個人工氣候箱(光照強度均為180 J·s?1)內(nèi)，干熱脅迫下噴灑了DTT 和去離子水的材料第8 天前均不再補水，直至第8 天測定相應(yīng)指標后才恢復(fù)常溫并進行復(fù)水處理；正常條件下噴灑了DTT 和去離子水的材料每隔4 d 澆一次水。于第4 小時、8 小時、12 小時、16 小時、24 小時、2 天、4 天、8 天和復(fù)水及恢復(fù)常溫后第4 天(分別以4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、2 d、4 d、8 d、r4 d 表示)分別取樣，測定正常條件和干熱脅迫下MsVDE基因相對表達量。

1.3 MsVDE 基因的克隆

紫花苜蓿總RNA 提取參照RNA 提取試劑盒3.0 說明書(北京華越洋生物科技有限公司)。以RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中豆科植物的VDE基因的cDNA 的保守序列，利用Primmer 5.0 軟件設(shè)計特異性引物MsVDE-1F、MsVDE-1R、 MsVDE-2F、 MsVDE-2R、 MsVDE-3F、MsVDE-3R (表1)，擴增中間序列片段，PCR 產(chǎn)物克隆測序。3′ RACE (巢氏PCR 反應(yīng)體系)：以3′ adaptor為反轉(zhuǎn)引物進行PCR，經(jīng)PCR 純化產(chǎn)物連接到pMD18-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，再以pMD18-T 載上的通用引物進行PCR，產(chǎn)物克隆測序。5′ RACE (巢氏PCR 反應(yīng)體系)：以特異性引物MsVDE-RT1/MsVDE-RT1 反轉(zhuǎn)，得到cDNA，經(jīng)RNase H 和TdT 處理后，進行巢氏PCR，產(chǎn)物回收測序。利用DNAstar軟件對測序獲得的序列進行拼接，得到MsVDEcDNA 的全長序列。引物合成及測序由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.4 MsVDE 基因的生物信息學(xué)分析

利用在線分析軟件對MsVDE基因的氨基酸序列(Translate, https://web.expasy.org/translate/)、蛋白理化性質(zhì)(EXPASy, https://web.expasy.org/protparam/)、保守結(jié)構(gòu)域(CDD, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、二級結(jié)構(gòu)(SOPMA, http://npsa-pbil.ibcp.fr/)、疏水性(ProtScale, https://web.expasy.org/protscale/)、亞細胞定位(Cell-PLoc2.0, http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/; WoLF PSORT, https://wolfpsort.hgc.jp/)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TMHMM2.0, http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行預(yù)測分析。

1.5 干熱脅迫下MsVDE 基因的表達分析

提取紫花苜蓿嫩葉的RNA 用于qRT-PCR，根據(jù)已克隆MsVDE基因的CDS (coding sequence)全長編碼序列，用Primer 5.0 設(shè)計熒光定量引物 (表1)，并選取18Sr RNA為內(nèi)參基因[28]。基因表達量測定反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex TaqⅡ(2X)，10 μL；上游引物F (10 μmol·L?1)，0.8 μL；下游引物F (10 μmol·L?1)，0.8 μL； ROX Reference Dye Ⅱ， 0.4 μL； Template(cDNA)，2 μL；ddH2O，6 μL；總體積為20 μL。實時熒光定量PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)40 次。通過熒光定量PCR 可得基因CT 值，采用2?△△CT方法[29]計算MsVDE基因的相對表達量，以18Sr基因為內(nèi)參基因，校正cDNA 模板的細胞拷貝數(shù)。

表1 MsVDE 基因克隆及熒光定量的引物序列Table 1 Gene cloning and fluorescence quantification primer sequences of MsVDE gene

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013 整理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，采用SigmaPlot 10.0 作圖。不同處理之間的差異性比較采用t檢驗，不同時間段之間的差異采用單因素方差分析，方差同質(zhì)性檢驗，當(dāng)方差齊性時進行多重比較檢驗；當(dāng)方差不齊時，使用Brown-Forsythe 的修正值和Games-Howell 方法。

2 結(jié)果

2.1 MsVDE 基因的克隆

所獲得的中間片段、3′端和5′端片段(圖1)進行拼接，得到MsVDE基因的全長cDNA 序列。將測序結(jié)果在NCBI 進行BLAST 分析，結(jié)果表明，所克隆的全長序列與其他植物VDE基因具有較高的同源性，表明克隆得到了MsVDE基因。

圖1 MsVDE 基因擴增結(jié)果Figure 1 Amplification results of MsVDE gene

2.2 MsVDE 基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)RACE 擴增后得到的cDNA 序列全長1 678 bp，通過核苷酸及氨基酸序列分析CDS 編碼區(qū)全長為1 608 bp，編碼535 個氨基酸，將該基因命名為MsVDE，GenBank 登錄號為MW883184。

經(jīng)EXPASY-ProtParam 預(yù)測，該基因的分子式為C2 738 h4192N718O797S27，編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量60.79 kDa，等電點為5.94，負電氨基酸殘基總數(shù)57，正電氨基酸殘基總數(shù)50，脂肪族氨基酸指數(shù)為84.84，不穩(wěn)定系數(shù)41.49，該蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，親水性總平均值為?0.181。利用NCBI 的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART)對MsVDE蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測(圖2)，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的特定匹配(specific hits)為GDNF(GDNF Superfamily)，該結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸(Gly, C)，位于蛋白質(zhì)序列區(qū)間256～318 bp，E-value 為3.77e?3，屬于脂質(zhì)蛋白超級家族(lipocalin superfamily)。PLN02372 則是超級家族cl21528 (脂質(zhì)蛋白/胞質(zhì)脂肪酸結(jié)合蛋白家族)的成員，位于序列區(qū)間239～513，E-value 為9.15e?15，描述為紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(violaxanthin de-epoxidase)。pfam07137[25]和PLN02372 均為超級家族cl21528 的成員。

圖2 紫花苜蓿 MsVDE 基因編碼蛋白質(zhì)的保守域Figure 2 Conserved domain of protein encoded by MsVDE gene in alfalfa

通過SOPMA 預(yù)測，MsVDE 包含多種二級結(jié)構(gòu)：α 螺旋158 AA (29.53%)，延伸鏈結(jié)構(gòu)118 AA (22.06%)，β 轉(zhuǎn)角32 AA (5.98%)，無規(guī)則卷曲227 AA (42.43%)。利用Prot Scale 進行蛋白質(zhì)的疏水性在線預(yù)測，MsVDE 的Score 值為-0.186，因此該蛋白總體上屬于親水性蛋白。利用Cell-PLoc2.0、WoLF PSORT 對MsVDE 的亞細胞定位進行預(yù)測，兩者結(jié)果均顯示定位于葉綠體。經(jīng)TMHMM2.0 對紫花苜蓿MsVDE的氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示，整條肽鏈位于膜外，即該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

經(jīng)DNAman 對紫花苜蓿氨基酸與其他物種進行相似性比對，MsVDE基因編碼的氨基酸與其他物種的VDE基因編碼的氨基酸序列有相同的保守區(qū)域(圖3)，結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域分析，該氨基酸序列包含了3 個特征區(qū)域：N-端半胱氨酸富集區(qū)(Cys-rich domain,256～318 bp)、 脂質(zhì)運載蛋白特征區(qū)(lipocalin domain, 239～513 bp)和C-端谷氨酸富集區(qū)(Glu-rich domain, 478～517 bp)，表明已成功克隆了紫花苜蓿紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的序列。

圖3 逸散紫花苜蓿與不同植物的VDE 基因氨基酸序列比對分析Figure 3 Schematic description of amino acid sequence alignment of MsVDE and homologous proteins

利用MEGA 6.0，將MsVDE基因的氨基酸序列與蒺藜苜蓿、密花豆、野生大豆等9 種植物VDE基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行聚類分析，結(jié)果表明MsVDE的氨基酸序列與蒺藜苜蓿的親緣關(guān)系最近，同源性達100%，與其他豆科植物聚為一類，而與可可樹(Theobroma cacao)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)的親緣關(guān)系最遠(圖4)。

圖4 紫花苜蓿與其他物種VDE 基因推導(dǎo)氨基酸進化樹Figure 4 Phylogenetic tree of deduced amino acid sequences of VDE in escaped alfalfa and other species

2.3 干熱脅迫下MsVDE 基因的表達分析

提取的紫花苜蓿葉片的RNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳凝膠檢測，并用紫外分光亮度計檢測其OD 值，其OD260/OD280均介于1.94～2.14，RNA 質(zhì)量較好，沒有降解，可用于反轉(zhuǎn)錄，進行后續(xù)試驗。

2.3.1 干熱脅迫對VDE基因表達的影響

逸散紫花苜蓿葉片在正常條件及干熱脅迫下MsVDE基因相對表達量的變化不同(圖5)。結(jié)果表明，在第4 小時至第2 天時，干熱脅迫下的MsVDE基因表達量差異均顯著低于正常條件(P＜ 0.05)。從第4 天起至復(fù)水后第4 天時的3 個時間段，干熱脅迫下MsVDE基因相對表達量均極顯著(P＜ 0.001)高于正常條件，第4 天和第8 天分別比正常條件上調(diào)了2.13 倍和1.97 倍。干熱處理復(fù)水后植株的MsVDE基因表達量雖顯著下降(P＜ 0.05)，但仍顯著高于脅迫期間的各水平(P＜ 0.05)。表明短期干熱處理并不能促使MsVDE基因表達上調(diào)，而干熱處理第4 天和第8 天時的MsVDE基因表達量極顯著上調(diào)(P＜0.001)，復(fù)水后仍極顯著高于正常條件(P＜ 0.001)。

圖5 干熱脅迫對MsVDE 基因表達的影響Figure 5 Effects of drought and heat stresses on MsVDE gene expression

2.3.2 噴灑DTT 溶液對MsVDE基因表達的影響

正常條件及干熱脅迫下，均以DTT 溶液噴灑植株葉片，測定葉黃素循環(huán)抑制劑對MsVDE基因相對表達量的影響(圖6)。結(jié)果顯示：除第12 小時和第8 天時，其余時間段干熱脅迫下MsVDE基因相對表達量極顯著(P＜ 0.001)低于正常條件。復(fù)水后，干熱脅迫的植株MsVDE基因表達顯著高于正常條件(P＜ 0.05)。干熱脅迫下MsVDE基因表達量的峰值出現(xiàn)在第12 小時，為3.54；正常條件下的峰值出現(xiàn)在第8 小時，為6.07。干熱脅迫下MsVDE基因表達量在第2 天至第8 天時都維持在0.53～1.18 的較低水平，這表明噴灑了DTT 溶液的紫花苜蓿在干熱脅迫一定時間段內(nèi)MsVDE基因表達量較正常條件有所下調(diào)，平均降低了55%。

圖6 噴灑DTT 溶液對MsVDE 基因表達的影響Figure 6 Effects of spraying dithiothreitol solution on MsVDE gene expression

2.3.3 干熱脅迫下噴灑DTT 溶液對MsVDE基因表達的影響

干熱脅迫下噴灑DTT 溶液與噴灑去離子水植株比較，其MsVDE基因相對表達量變化不同(圖7)。結(jié)果顯示：24 h 內(nèi)，除第16 小時外，噴灑DTT 溶液相對于噴灑去離子水并未表現(xiàn)出抑制作用。在第2、4、8 天和復(fù)水后第4 天時噴灑DTT 溶液較噴灑去離子水MsVDE基因的相對表達量分別下調(diào)了72%、42%、86%和68%，存在極顯著差異(P＜ 0.01)。因此，DTT溶液對MsVDE基因表達量只在第2 天后及復(fù)水后第4 天表現(xiàn)為平穩(wěn)的抑制作用，平均下調(diào)了67%。

圖7 干熱脅迫下葉黃素循環(huán)抑制劑對MsVDE 基因相對表達量的影響Figure 7 Effects of xanthophyll cycle inhibitors on relative expression of MsVDE gene under drought and heat stresses

3 討論與結(jié)論

高等植物中，VDE基因處于類胡蘿卜素合成途徑的分枝，迄今為止，未見MsVDE基因與干熱脅迫下該基因表達特征的研究報道。本研究從生長在干熱河谷地區(qū)的逸散紫花苜蓿中克隆了MsVDE基因，通過與豆科及其他植物的序列比對分析，結(jié)果表明氨基酸序列具有較高的保守型和相似性。經(jīng)亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示定位于葉綠體，與歐李的ChVDE亞細胞定位一致[24]。Huang 等[15]克隆了生姜的VDE基因，經(jīng)同源性比對分析與紫花苜蓿和普通小麥比較接近，推導(dǎo)出的GVDE氨基酸序列包含已知VDE的保守特征，具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和脂質(zhì)運載蛋白特征。和大多數(shù)植物的VDE基因類似，MsVDE基因具有3 個特征區(qū)域，即N-端半胱氨酸富集區(qū)、脂質(zhì)運載蛋白特征區(qū)和C-端谷氨酸富集區(qū)[30]，其中，中央脂質(zhì)運載蛋白結(jié)構(gòu)域是最具特征的。

Rizhsky 等[31]研究表明煙草對兩種逆境并存的分子反應(yīng)與單一逆境反應(yīng)也明顯不同，一些基因的轉(zhuǎn)錄在干旱或者高溫條件下升高，但是在兩種逆境共同脅迫下降低，另外一小部分基因在共同脅迫下轉(zhuǎn)錄上調(diào)?；虮磉_也有可能與脅迫強度有關(guān)，在對黃瓜的CsVDE克隆研究中表明，光強的變化可改變VDE的表達的模式，弱光條件下與正常光照條件相比，基因表達發(fā)生了延遲，而在高強度光照1 h后，CsVDE轉(zhuǎn)錄迅速誘導(dǎo)，隨后下降。在CsVDE啟動子的研究中發(fā)現(xiàn)，它是一類新的綠色組織特異性強的植物啟動子，它包含基因表達的陽性和陰性調(diào)節(jié)因子，其活性受激素和非生物脅迫的調(diào)節(jié)，激素改變了CsVDE啟動子的活性，非生物脅迫受吲哚-3-乙酸和赤霉素的正向影響，但受聚乙二醇、脫落酸、水楊酸、甘露醇和氯化鈉的負向影響。CsVDE啟動子片段的高光響應(yīng)隨處理時間和光強而變化，且發(fā)現(xiàn)了高光響應(yīng)和適宜水平光響應(yīng)的臨界區(qū)域[18]。DTT 是強還原劑，可通過阻止VDE的半胱氨酸富集區(qū)形成二硫鍵，從而抑制VDE 蛋白活性[25,32]。二硫化物的減少導(dǎo)致剛性結(jié)構(gòu)的損失，熱穩(wěn)定性降低了15 ℃[33]。通過截斷脂質(zhì)運載蛋白周圍的結(jié)構(gòu)域表明，沒有C-末端結(jié)構(gòu)域的情況下VDE可能有活性，但在沒有N-末端結(jié)構(gòu)域的情況下VDE是不可能有活性的[34]。綜合來看，VDE基因的表達可能受光照強度、多種條件共同脅迫、外源制劑或受啟動子活性的影響，并可能存在對光響應(yīng)的臨界區(qū)域。因此，本研究中紫花苜蓿MsVDE基因的相對表達量受干熱共同脅迫、脅迫強度及葉黃素循環(huán)抑制劑(DTT)的影響。另外，正常條件下MsVDE表達呈現(xiàn)差異性變化，推測一方面受人工氣候箱內(nèi)光照規(guī)律變化的影響，另外一方面有研究表明，葉黃素循環(huán)機制對水分有明顯地響應(yīng)[35]，本研究每隔4 d 對紫花苜蓿澆一次水，MsVDE表達可能受到了水分變化的影響。

葉黃素循環(huán)的脫環(huán)氧化和環(huán)氧化過程是雙向的，其環(huán)氧化過程對葉黃素循環(huán)同樣有調(diào)控作用。Bethmann 等[36]報告了豌豆(Pisum sativum)、擬南芥、本氏煙草(Nicotiana benthamiana)和菠菜(Spinacia oleracea) 4 種植物葉片隨光抑制增強，玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZEP)活性逐漸下降，ZEP 和D1 蛋白降解是一種光保護機制。在碳酸鈉脅迫下VDE 和ZEP 的表達下調(diào)，葉黃素循環(huán)受到抑制[37]。Xie 等[38]采用水楊醛肟(SA)抑制石莼(Ulva lactuca)的ZEP 活性，然后用各種代謝抑制劑在弱光和黑暗條件下表征VDE 活性。VDE 和ZEP 在植物體內(nèi)具有拮抗作用，體內(nèi)VDE 活性往往因ZEP 的存在而受阻，因此，使用抑制劑抑制ZEP 可能是表征體內(nèi)VDE 活性的另一種方法。在中等光照條件下，由于ZEP 與VDE 持續(xù)循環(huán)，當(dāng)用水楊酸(salicylaldoxime, SA)抑制ZEP催化葉黃素循環(huán)的反向反應(yīng)時，即使在很低的光強下，A 和Z 也發(fā)生了明顯的積累，保護紫花苜蓿免受熱損傷。ZEP 是脫落酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，而脫落酸途徑與植物抗逆性相關(guān)[39]，在西紅柿中當(dāng)ZEP 過量表達會增加對強光的敏感性[40]。ZEP 與VDE 基因之間是否存在互作效應(yīng)？另外，基因與環(huán)境相互作用對于種群和如何應(yīng)對不可預(yù)測的環(huán)境至關(guān)重要[41]，這些問題的闡明對調(diào)控葉黃素循環(huán)關(guān)鍵酶作用的分子機制、豐富和發(fā)展紫花苜蓿光合作用理論同樣重要。

本研究利用RACE 技術(shù)首次從逸散紫花苜蓿中成功克隆到MsVDE基因，cDNA 全長1 678 bp，CDS編碼區(qū)1 608 bp，編碼535 個氨基酸，GenBank 登錄號為MW883184。經(jīng)預(yù)測，其編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量60.79 kDa，等電點為5.94，該蛋白不穩(wěn)定，屬于親水性蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。干熱脅迫及噴灑葉黃素循環(huán)抑制劑后，通過實時熒光定量分析，初步確定云南逸散紫花苜蓿的MsVDE基因在調(diào)控葉黃素循環(huán)應(yīng)對干熱脅迫中起作用，為進一步闡明干熱脅迫下葉黃素循環(huán)對逸散紫花苜蓿的光保護作用奠定了基礎(chǔ)。