張健唯，梁 宸，劉助水

（1.北京燕京啤酒股份有限公司，北京 100083；2.燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司，廣西桂林 541002）

啤酒的風味質量包括啤酒的風味強度、風味組成和風味穩(wěn)定性三個主要方面，啤酒的口感一致性和風味穩(wěn)定性對消費者的影響比較直接、重要，受到啤酒行業(yè)的廣泛關注，提高啤酒的口感一致性和風味穩(wěn)定性也是啤酒行業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)。

酚類是構成啤酒活性風味物質的重要組成之一，已經檢測出的有揮發(fā)性酚、愈創(chuàng)木酚、苯酚等，其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol,4-VG）是小麥啤酒的特征性香氣物質，具有揮發(fā)性，有獨特發(fā)酵香氣，嗅覺識別度較高，能夠給小麥啤酒帶來特殊香味。4-VG 并非天然存在于啤酒原料中，而是在生產啤酒的制麥、糖化和發(fā)酵各個環(huán)節(jié)中由阿魏酸發(fā)生脫羧反應。4-VG 的產生途徑有兩種：（1）前體物質阿魏酸經過高溫熱脫羧反應生成4-VG；（2）阿魏酸經過酶催化脫羧反應生成4-VG。

白啤是小麥啤酒的一種，關于糖化工藝參數(shù)對白啤4-VG 含量影響的研究較多，但關于發(fā)酵工藝參數(shù)對白啤4-VG 含量影響的研究不是非常完全。因此，本研究系統(tǒng)研究酵母菌種、酵母代數(shù)、酵母接種量、發(fā)酵溫度、冷麥汁充氧量5 種發(fā)酵工藝參數(shù)對白啤4-VG 含量的影響，以期通過優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)提高白啤中4-VG的含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料和菌株：大麥芽（麥特卡夫），粵海永順泰（廣州）麥芽有限公司；小麥芽，歐麥(保定)麥芽有限公司；酵母菌株，燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司保藏。

試劑及耗材：乙腈（色譜純），美國Fisher 公司；三氟乙酸（純度99.5%），阿拉丁試劑（上海）有限公司；4-VG（純度98%），德國Sigama公司。

儀器設備：液相色譜儀（規(guī)格型號：1200系列），安捷倫科技（中國）有限公司；紫外檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司；電子天平（精度0.0001 g），梅特勒-托利多集團；超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；燕京啤酒（桂林漓泉）股份有限公司精釀啤酒生產線（糖化麥汁單鍋產量2 t，發(fā)酵一鍋麥汁進罐），寧波樂惠國際工程裝備股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥汁制備

原料配比為60%大麥芽+40%小麥芽，麥芽采用干法粉碎，下料溫度38 ℃（保溫時間10 min），蛋白質休止溫度45 ℃（保溫時間10 min），糖化溫度63 ℃（保溫時間30 min），糖化溫度72 ℃（保溫時間25 min），醪液升溫到76 ℃后送入過濾槽，煮沸90 min（蒸發(fā)率控制8%），回旋沉淀30 min，麥汁冷卻35 min（冷麥汁溫度與發(fā)酵溫度相同），充氧后進入立式發(fā)酵罐進行發(fā)酵。冷麥汁理化指標控制：原麥汁濃度12°P±0.3°P，氨基氮250 mg/L±20 mg/L，總酸1.6 mL/100 mL±0.1 mL/100 mL，pH5.6±0.1，色度10 EBC±1 EBC。

1.2.2 發(fā)酵工藝

根據(jù)實驗需要，調整5 種發(fā)酵工藝參數(shù)。一是接種的酵母菌株，分別采用公司保藏的4 款上面酵母，編號為No.1、No.2、No.3、No.4，0 代酵母經實驗室純培，再用20 L卡式罐下種至精釀啤酒生產線進行擴培，最后根據(jù)發(fā)酵工藝的酵母接種量，將擴培液送入發(fā)酵罐，再將冷麥汁送入發(fā)酵罐；二是酵母代數(shù)，分別為0 代、1 代、2 代、3 代，除0 代酵母之外，其余代數(shù)的酵母通過酵母在線添加管道，在冷麥汁進罐0.1 t 且冷麥汁溫度穩(wěn)定后定量添加；三是酵母接種量，分別為4 百萬個/mL、6 百萬個/mL、8 百萬個/mL、10 百萬個/mL，除0 代酵母之外，其余代數(shù)的酵母通過使用ABER 活性酵母計數(shù)儀進行定量添加，從而達到試驗酵母接種量的要求；四是發(fā)酵溫度，分別為14 ℃、16 ℃、18 ℃、20 ℃；五是冷麥汁充氧量，分別為18 mg/L、20 mg/L、22 mg/L、24 mg/L（mg/L表示每升冷麥汁充入氧氣的質量），充氧后段使用蛇形管，以提高冷麥汁充氧的效果。

1.2.3 4-VG含量的測定

從發(fā)酵液滿罐后第1 天起，每天上午定時取樣，測量發(fā)酵液4-VG 含量。檢測方法參考T/CBJ 3103—2020白啤酒團體標準中高效液相色譜法（第一法）進行測定。檢測步驟大致如下：先制定標準溶液/校正曲線、控制樣，再將樣品經振蕩脫氣，先后經過單層中速濾紙、0.22 μm過濾頭過濾，直接進樣，最后進行結果計算，結果取小數(shù)點后一位。

2 結果與分析

2.1 酵母菌種對白啤4-VG含量的影響

試驗將酵母菌株設置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母代數(shù)0 代、酵母接種量6百萬個/mL、發(fā)酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。酵母是啤酒的靈魂，它對啤酒風味起著決定性作用，接種不同酵母釀造出的啤酒風味各異，選擇適宜的上面發(fā)酵酵母是產生白啤特色丁香香氣的關鍵因素。

如圖1 所示，4 種不同酵母釀造的白啤中4-VG含量差異明顯。上面發(fā)酵酵母的POF（phenolic off-flavour）基因編碼的阿魏酸脫羧酶能夠催化4-VG 的前體物質阿魏酸脫羧生成4-VG，從而賦予白啤酚香味。上面發(fā)酵酵母中含有POF 基因，賦予小麥啤酒酚香味，根據(jù)酚香味的差異將上面發(fā)酵酵母分為POF+型和POF-型，POF+酵母比POF-酵母產生的酚香和丁香香氣更加濃郁。能夠釀造啤酒產生4-VG 含量高于2.5 mg/L 的酵母為POF+酵母，低于此含量的為POF-酵母。

圖1 酵母菌種與4-VG含量的關系

試驗的4 種上面酵母中，No.3 和No.4 發(fā)酵產生的4-VG 含量較高，No.2 發(fā)酵產生的4-VG 含量適中，No.1 發(fā)酵產生的4-VG 含量較少。此結果證明上面酵母No.3和No.4為POF+菌，上面酵母No.1和No.2為POF-菌。

在選擇酵母的同時需要考慮其對白啤“酸感”帶來的影響，口感過酸往往會降低消費者的體驗感。乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸是白啤釀造過程中帶來“酸感”的主要物質，不同酵母對以上4 種酸的代謝能力差別較大。本研究的檢測和品評結果顯示，上面酵母No.3 和No.4 釀造的白啤在產生4-VG含量合適的情況下，“酸感”表現(xiàn)良好。

2.2 酵母代數(shù)對白啤4-VG含量的影響

試驗將酵母代數(shù)設置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母No.3、酵母接種量6 百萬個/mL、發(fā)酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。

如圖2 所示，用0 代到3 代酵母釀造的白啤中4-VG 含量呈逐漸下降趨勢，這與上面酵母中苯丙烯酸活性脫羧酶PADl(POFl)的作用效果有關。本試驗使用立式發(fā)酵罐，采用一罐法進行釀造，只有在對發(fā)酵罐降溫后，才能從發(fā)酵罐錐底得到足夠多的上面酵母，從而進行傳代投料試驗，此時酵母已長時間處于缺乏營養(yǎng)狀態(tài)，且初期沉降下來的酵母，其自身活力及脫羧酶活性相對較弱。隨著酵母代數(shù)增多，白啤4-VG 含量會逐漸下降。根據(jù)本公司的研發(fā)生產經驗，要想保持口感和風味的穩(wěn)定性，對于大部分酵母來說，一般將代數(shù)控制在3 代以內為佳。這一論斷也并不是絕對的，與酵母菌株的特性有關，有些酵母控制在第5 代也不會對生產造成明顯的不良影響。

圖2 酵母代數(shù)與4-VG含量的關系

2.3 酵母接種量對白啤4-VG含量的影響

試驗將酵母接種量設置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母No.3、酵母代數(shù)0 代、發(fā)酵溫度18 ℃和冷麥汁充氧量20 mg/L。

如圖3 所示，白啤中4-VG 的含量隨著酵母接種量的增加而上升，當酵母添加量大于6 百萬個/mL時，4-VG 的含量高于5 mg/L。接種量的多少直接影響發(fā)酵周期長短、酵母的生長繁殖速度、酵母峰值和風味代謝物質的含量。適宜的接種量可為酵母創(chuàng)造種群優(yōu)勢，排除雜菌的影響。接種量通過影響酵母的增殖數(shù)量和發(fā)酵速度，間接對白啤中4-VG等酚類物質產生影響。

圖3 酵母接種量與4-VG 含量的關系

上面酵母的酵母接種量不建議太高，一般控制在15 百萬個/mL 以內為佳。過高的酵母接種量，一方面會造成發(fā)酵液前期降糖速度偏快，出現(xiàn)溢泡現(xiàn)象，容易染菌；另一方面，酵母在高溫下大量繁殖會導致酒液的雜醇和總酸含量增加，進而嚴重影響啤酒的口感協(xié)調性和可飲性，消費者會出現(xiàn)飲后“上頭”的現(xiàn)象。

2.4 發(fā)酵溫度對白啤4-VG含量的影響

試驗將發(fā)酵溫度設置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母No.3、酵母代數(shù)0代、酵母接種量10百萬個/mL 和冷麥汁充氧量20 mg/L。上面發(fā)酵酵母發(fā)酵溫度通常高于下面發(fā)酵酵母，一般控制在15～25 ℃。發(fā)酵溫度通過影響酵母新陳代謝的速度進而影響發(fā)酵所產生的風味物質含量。發(fā)酵過程中酶催化脫羧反應生成4-VG，合理控制發(fā)酵溫度有利于酵母處于最佳生長繁殖狀態(tài)及阿魏酸脫羧酶在最適反應條件下發(fā)揮催化作用，進而提高最終白啤中的4-VG 含量。一般情況下，發(fā)酵溫度不同，白啤中4-VG 含量存在一定的差異，4-VG含量隨發(fā)酵溫度的升高而上升。

如圖4 所示，當溫度設置為16 ℃時，4-VG 含量上升速率較慢，且最終含量較低，說明此溫度未能使酶充分發(fā)揮活性達到轉化阿魏酸的目的；在18～20 ℃，4-VG 含量上升較快，說明溫度在此區(qū)間內越來越接近酶的最適反應溫度，酶的活性逐漸提高?？紤]到啤酒生產中的能耗和發(fā)酵過程中會生成其他風味物質，酵母在代謝氨基酸和糖的過程中同時會產生雜醇，發(fā)酵溫度過高會使啤酒中的雜醇含量過高、總酸偏高、苦味值低、泡沫性能差且容易染菌，對成品酒風味造成不良影響。當發(fā)酵溫度超過20 ℃時，4-VG 含量的增幅小于醇類的增幅，醇類增幅相對較多，飲后易出現(xiàn)“上頭”現(xiàn)象。

圖4 發(fā)酵溫度與4-VG含量的關系

2.5 冷麥汁充氧量對白啤4-VG含量的影響

試驗將冷麥汁充氧量設置為變量，其余發(fā)酵工藝參數(shù)為：酵母No.3、酵母代數(shù)0 代、酵母接種量10百萬個/mL和發(fā)酵溫度20 ℃。

如圖5 所示，白啤中4-VG 的含量隨著冷麥汁充氧量的增加而上升，且在18～22 mg/L 范圍內4-VG 含量上升較快。提高冷麥汁充氧量會提高酵母數(shù)的峰值，發(fā)酵罐內的酵母峰值越高，阿魏酸經過酶催化脫羧反應生成的4-VG 就會越多。當冷麥汁充氧量超過22 mg/L 時，4-VG 含量變化趨勢逐漸平穩(wěn)，此時冷麥汁的溶氧量已基本達到飽和狀態(tài)，即使再提高冷麥汁充氧量，過飽和部分的氧在麥汁進罐過程中也會很快形成氣泡逸出發(fā)酵罐，不能被酵母所利用，酵母數(shù)的峰值不會有明顯提高，4-VG含量就不會再增加。

圖5 冷麥汁充氧量與4-VG 含量的關系

值得注意的是，增加冷麥汁充氧量會提高酵母數(shù)的峰值，啤酒中雜醇和總酸的含量也會增加，總酯含量減少；充氧量過低不利于酵母增殖，會使乙醛含量上升、發(fā)酵周期延長。所以在設計冷麥汁充氧量時，不能單方面的考慮4-VG 含量，也需兼顧白啤其他指標。

3 結論

近年來，我國啤酒行業(yè)開始從擴大規(guī)模向提高檔次的發(fā)展方向轉變，各啤酒品牌相繼推出白啤產品來布局高端市場。白啤具有特殊的丁香香氣，酒體渾濁且泡沫豐富，口感飽滿且苦味值較低。本文通過單因素試驗研究了酵母菌種、酵母代數(shù)、酵母接種量、發(fā)酵溫度和冷麥汁充氧量這5 種發(fā)酵工藝參數(shù)對白啤4-VG 含量的影響，其中酵母菌種的影響最大。對于白啤的釀造，應該提高4-VG 含量而突出其丁香的香氣特征，但不能單一考慮此因素而影響乙醛、雜醇、總酸和總酯等指標的含量，對產品風味和口感造成損失，應該兼顧白啤風味的平衡性和穩(wěn)定性、口感的一致性和可飲性?；谝陨峡剂坎⒔涍^多次試驗驗證，得到提高白啤中4-VG 含量的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:以燕京漓泉公司保藏的No.3酵母為發(fā)酵酵母、酵母代數(shù)0代、酵母接種量10百萬個/mL、發(fā)酵溫度20 ℃、冷麥汁充氧量22 mg/L。在最佳發(fā)酵工藝條件下釀造出的白啤產品丁香香氣特征突出，無其他異雜味，口感豐富、一致性和可飲性良好，酒體平衡、穩(wěn)定、協(xié)調。本研究為釀造白啤工藝提供了參考依據(jù)。