徐國峰

【摘要】 目的：研究糞菌移植（FMT）對酒精性肝損傷（ALI）大鼠腸黏膜屏障功能及肝功能的影響。方法：2021年4-6月將30只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組（C組）、酒精模型組（M組）和FMT治療組（T組），每組10只。C組給予等容量蒸餾水灌胃，基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng);M組、T組按10 mL/kg，給予56°白酒灌胃，持續(xù)8周，第5周開始，T組給予糞菌液灌胃，C組及M組均給予生理鹽水。測定并比較各組大鼠的生理學指標（體重、肝指數(shù)）、血液相關(guān)指標[D-乳酸（D-LA）、血漿內(nèi)毒素水平（ET）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）]，對肝組織進行HE染色，觀察光鏡下肝組織病理變化，并對其進行病理診斷與Scheuer評分。結(jié)果：第2、7、8周，與C組相比，M組與T組大鼠的體重均顯著降低（P<0.05）;第7、8周，T組體重均顯著高于M組（P<0.05）。與C組相比，M組與T組大鼠的肝指數(shù)、D-LA、ET、TNF-α、ALT、AST均顯著升高（P<0.05），且T組均顯著低于M組（P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示，C組大鼠肝細胞無損傷，M組與T組大鼠肝細胞發(fā)生損傷，且T組大鼠肝細胞損傷程度低于M組。三組炎癥活動度分級和纖維化程度分期比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其中M組的炎癥活動度分級與纖維化程度分期均高于T組與C組（P<0.05），而T組與C組炎癥活動度分級與纖維化程度分期比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：FMT可以有效保護大鼠腸黏膜屏障功能，緩解炎癥，改善肝功能，對酒精導(dǎo)致的大鼠肝損傷具有并保護作用。

【關(guān)鍵詞】 糞菌移植 酒精性肝損傷 腸黏膜屏障功能 肝功能

Effects of Fecal Microbiota Transplantation on Intestinal Mucosal Barrier Function and Liver Function in Rats with Alcoholic Liver Injur/XU Guofeng. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： 00-009

[Abstract] Objective： To study the effects of fecal microbiota transplantation （FMT） on intestinal mucosal barrier function and liver function in rats with alcoholic liver injury （ALI）. Method： From April to June 2021， 30 male SD rats were randomly divided into normal control group （group C）， alcohol model group （group M） and FMT treatment group （group T）， with 10 rats in each group. Group C was given equal volume distilled water by intragastric administration and basal feed; group M and group T were given 10 mL/kg of 56° liquor intragastric administration for 8 weeks， from the 5th week， group T was given fecal bacteria solution intragastric administration， and group C and group M were given normal saline. Physiological indexes （body weight， liver index） and blood related indexes （D-LA， ET， TNF-α， ALT， AST） were measured and compared， and liver tissue was stained with HE， the pathological changes of liver tissue under light microscope were observed， and the pathological diagnosis and Scheuer score were performed. Result： At the 2th， 7th and 8th weeks， compared with group C， the weight of rats in group M and group T decreased significantly （P<0.05）; at the 7th and 8th weeks， the weight of group T were significantly higher than that of group M （P<0.05）. Compared with group C， the liver index， D-LA， ET， TNF-α， ALT and AST in group M and group T were significantly higher （P<0.05）， and those in group T were significantly lower than those in group M （P<0.05）. The results of HE staining showed that there was no damage to hepatocytes in group C， and hepatocytes were injured in group M and group T， and the degree of hepatocyte damage in group T was lower than that in group M. There were statistically significant differences in inflammatory activity grade and fibrosis stage among the three groups （P<0.05）; the inflammation activity grade and fibrosis stage of group M were higher than those of group T and group C （P<0.05）， and there were no significant differences in inflammatory activity grade and fibrosis stage between group T and group C （P>0.05）. Conclusion： FMT can effectively protect the intestinal mucosal barrier function， alleviate inflammation， improve liver function， and protect the liver injury induced by alcohol.

[Key words] Fecal microbiota transplantation Alcoholic liver injury Intestinal mucosal barrier function Liver function

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.002

長期大量飲酒可導(dǎo)致不同程度的酒精性肝損傷（alcoholic liver injury，ALI），進而導(dǎo)致酒精性肝炎、肝纖維化，最終演變成肝硬化，目前，ALI的發(fā)病率與死亡率在不斷增加，研究顯示，全球（1 500～

2 000）萬人存在酗酒情況，而其中有10%～20%的人存在不同程度上的酒精性肝病[1-2]。隨著腸-肝軸學說的提出以及對腸道微生態(tài)研究的進一步深入，腸黏膜屏障功能在ALI發(fā)病過程中的作用越來越受到重視，糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）療法成為當下研究的一大熱點[3-6]。研究表明，酒精可導(dǎo)致腸道微生物群失調(diào)，腸道細菌過度生長和致病菌移位，而正常的腸道菌群是腸道天然的生物屏障[7-8]。因此，在ALI患者的治療中應(yīng)考慮尋求恢復(fù)腸內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)的治療方法。本研究通過建立大鼠ALI模型，探究FMT對大鼠腸黏膜屏障功能及肝功能的影響，來評價其對大鼠ALI的治療保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 糞菌液制備 于清晨稱量5 g正常對照的大鼠糞便，加入50 mL 0.9%氯化鈉溶液中攪拌;獲得懸液后，使用雙層無菌紗布進行過濾;將過濾后的懸液進行離心，去掉上層清液，再次加入50 mL 0.9%氯化鈉溶液溶解，獲得無色無味的糞菌液[9]。

1.1.2 實驗動物 30只SPF級SD大鼠，雄性，8周齡，購于蘇州西山生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-00014。

1.1.3 主要實驗試劑 56°白酒購自北京順鑫牛欄山酒廠;奧美拉唑鎂腸溶片（生產(chǎn)廠家：阿斯利康制藥有限公司，批準文號：國藥準字J20130093，規(guī)格：20 mg）;烏拉坦（生產(chǎn)廠家：齊魯制藥有限公司，批準文號：國藥準字H37022259，規(guī)格：0.5 g），用0.9%氯化鈉溶液溶解烏拉坦制成20%烏拉坦注射液;蘇木素染液、伊紅染色液、Scott藍化液、超凈高級封片膠均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ALI大鼠動物模型的建立與分組 于2021年4-6月取成年雄性SD大鼠30只，體重200～250 g，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將其隨機分為三組，每組10只。正常對照組（C組）給予等容量蒸餾水灌胃，基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng);酒精模型組（M組）和FMT治療組（T組）按10 mL/kg，給予56°白酒灌胃，持續(xù)8周。第5周開始，T組給予糞菌液灌胃，2 mL/次，隔日一次;C組及M組同時給予生理鹽水2 mL/次，在灌胃的前1 d晚上及當天早上均給予奧美拉唑鎂腸溶片灌胃（10 mg/kg），以提高胃內(nèi)pH值。于喂養(yǎng)第8周末腹腔注射20%烏拉坦注射液（6 mL/kg）麻醉后采血處死各組大鼠，留取實驗標本。建模和分組方法參考文獻[10]。

1.2.2 生理學指標觀察 記錄各組大鼠的體重變化;在處死大鼠后，剖檢取出肝臟進行稱量，并計算肝指數(shù)。肝指數(shù)（%）=肝重（g）/體重（g）×100%。

1.2.3 血液相關(guān)指標檢測 FMT治療結(jié)束后，空腹12 h，麻醉后取腹主動脈血制備血清及10%肝組織勻漿，采用改良的酶學分光光度法檢測血漿D-乳酸（D-LA）;采用終點顯色法鱟試驗技術(shù)檢測血漿內(nèi)毒素（ET）;采用ELISA技術(shù)檢測血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平;采用全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。

1.2.4 病理剖檢 處死動物后，經(jīng)腹主動脈取血后暴露肝臟，留取肝左葉相同部位的肝組織約5 mm×5 mm×5 mm兩塊，生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干水分后，一塊立刻置于液氮罐中冷凍備用，另一塊置于盛有10%多聚甲醛溶液的標本瓶中備用。

1.2.5 HE染色 將各組大鼠的肝臟組織標本按常規(guī)包埋，制作石蠟切片，經(jīng)HE染色處理后，光鏡下觀察肝臟組織病理學改變情況。

1.2.6 肝臟病理診斷評分 采用Scheuer評分對各組大鼠的肝臟病理損傷情況進行評分。按炎癥活動度不同分為5級：G級，門管區(qū)周圍無或輕度炎癥，小葉內(nèi)無炎癥;G級，門管區(qū)周圍炎癥，小葉內(nèi)有炎癥但無壞死;G級，門管區(qū)周圍輕度碎片狀壞死，小葉內(nèi)有點灶狀壞死或嗜酸小體;G級，門管區(qū)周圍中度碎片狀壞死，小葉內(nèi)有重度灶壞死;G級，門管區(qū)周圍重度碎片狀壞死，小葉內(nèi)有橋接壞死。按纖維化程度不同分為5期：S期，無纖維化;S期：門管區(qū)擴大;S期，門管區(qū)周圍纖維化，小葉結(jié)構(gòu)保留;S期，纖維化伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化;S期，肝硬化[11]。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以（x±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，等級資料采用Kruskal-Wallis H檢驗進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及生理學指標檢測結(jié)果 造模期間，各組大鼠的飲食與糞便均正常，未出現(xiàn)呼吸道或消化道等其他疾病。第2、7、8周，M組與T組大鼠體重均顯著低于C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;第7、8周，T組大鼠體重均顯著高于M組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。M組與T組大鼠肝指數(shù)均顯著高于C組，且T組顯著低于M組（P<0.05）。見表1。

2.2 血液相關(guān)指標檢測結(jié)果 M組與T組大鼠的D-LA、ET、TNF-α、ALT與AST水平均顯著高于C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;T組大鼠的D-LA、ET、TNF-α、ALT與AST水平均顯著低于M組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 HE染色結(jié)果 C組大鼠肝組織以中央靜脈為中心向周圍放射狀排列，結(jié)構(gòu)完整;M組可以看到肝細胞深染固縮，組織內(nèi)有大小不等的脂肪滴及炎癥細胞，組織結(jié)構(gòu)紊亂;與M組比較，T組未見明顯的脂肪細胞及炎癥細胞，病理病變得到改善。見圖1。

2.4 肝臟病理診斷評分結(jié)果 對各組大鼠肝臟切片進行病理診斷評分，結(jié)果顯示，三組炎癥活動度分級和纖維化程度分期比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其中M組的炎癥活動度分級與纖維化程度分期均高于T組與C組（χ=2.399、3.358，P=0.049、0.002;χ=3.590、4.488，P=0.001、0.000），而T組與C組炎癥活動度分級與纖維化程度分期比較，差異均無統(tǒng)計學意義（χ=0.959、0.369，P>0.05）。見表3。

3 討論

腸道血液可通過門靜脈系統(tǒng)匯集至肝臟，從而使肝臟與腸道產(chǎn)生聯(lián)系，形成腸-肝軸。近年來，隨著對腸-肝軸的研究不斷深入，腸黏膜屏障在ALI發(fā)生和發(fā)展過程中的重要作用被不斷提出[12-13]。肝臟是機體代謝酒精的主要場所，早期研究表明，ALI的發(fā)病機制在概念上可分為乙醇介導(dǎo)的肝損傷，損傷引起的炎癥免疫反應(yīng)，以及腸道通透性和微生物群的變化，表明長期大量飲酒會導(dǎo)致腸黏膜屏障受損，腸道菌群失調(diào)[14-15]。D-LA是α-羥基丙酸，當腸黏膜屏障被破壞時，腸黏膜通透性增加，腸道中的細菌會大量繁殖并產(chǎn)生D-LA，導(dǎo)致血液中的D-LA水平升高;同時，腸黏膜屏障被破壞，還會引起腸源性內(nèi)毒素血癥，過量的ET通過腸-肝軸轉(zhuǎn)移進入肝臟與血液循環(huán)，可促發(fā)嚴重的炎癥反應(yīng)與肝臟損傷[16-17]。肝臟Kupffer細胞（KC）是機體產(chǎn)生TNF-α的主要部位，相關(guān)研究表明，激活的KC產(chǎn)生的TNF-α、IL-6、IL-1β等與ALI發(fā)展具有密切相關(guān)性[18-19]。ALT與AST是評價肝細胞損傷的靈敏指標，可以反映肝細胞受損或壞死程度，當肝臟受損時，ALT與AST大量釋放進入血液，引起不同程度的增高。

FMT是指將健康者的糞便菌群移植到患者腸道內(nèi)，從而重建腸道正常菌群的方法。近年來，F(xiàn)MT作為解決與腸道微生物群失衡有關(guān)的腸內(nèi)和腸外各種疾病的有效方法而受到廣泛關(guān)注[20-22]。相關(guān)研究表明，人類腸道微生物群具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用[23]。為了進一步對FMT治療大鼠ALI效果深入研究，本研究對SD大鼠建立ALI動物模型，隨機分為C組、M組和T組，結(jié)果顯示，M組與T組大鼠的體重較C組均顯著降低（P<0.05），而肝指數(shù)、D-LA、ET、TNF-α、ALT、AST均顯著升高（P<0.05），表明ALI大鼠模型建模成功。進一步分析顯示，T組大鼠的肝指數(shù)、D-LA、ET、TNF-α、ALT、AST均顯著低于M組（P<0.05）。此外，病理診斷作為肝病確診的“金標準”，因此本研究分別對各組大鼠的肝組織進行病理診斷與Scheuer評分，病理切片結(jié)果顯示C組大鼠肝組織無損傷，M組與T組大鼠肝索紊亂，且M組可見脂肪滴與炎癥細胞，表明T組大鼠肝細胞損傷程度低于M組，對各組大鼠進行的Scheuer評分結(jié)果也顯示，M組的炎癥活動度分級與纖維化程度分期均高于T組與C組（P<0.05），而T組與C組炎癥活動度分級與纖維化程度分期比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。進一步表明，F(xiàn)MT對大鼠ALI具有積極的治療作用，對于大鼠各項指標均有顯著改善作用。

綜上所述，經(jīng)過FMT治療的ALI大鼠腸黏膜屏障功能、肝功能得到有效改善，炎癥得以緩解，表明FMT對ALI大鼠具有積極的治療作用，因此，F(xiàn)MT可作為ALI的潛在治療選擇進一步深入研究。

參考文獻

[1] BAJAJ J S.Alcohol，liver disease and the gut microbiota[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2019，16（4）：235-246.

[2]竇慧馨，張得鈞.酒精性肝病分子發(fā)病機制研究進展[J].基因組學與應(yīng)用生物學，2016，35（7）：1643-1647.

[3] ZHANG F，CUI B，HE X，et al.Microbiota transplantation： concept， methodology and strategy for its modernization[J].Protein Cell，2018，9（5）：462-473.

[4] WANG J W，KUO C H，KUO F C，et al.Fecal microbiota transplantation：Review and update[J].J Formos Med Assoc，2019，118（Suppl 1）：s23-s31.

[5]吳成成，羅文兵，肖慧榮，等.基于TLR4/NF-κB分析“金汁”糞菌移植干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的機制[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2021，18（31）：1-5.

[6]桂冠，易健，張善金，等.糞菌移植療法治療晚期結(jié)直腸癌FOLFIRI化療方案相關(guān)難治性腹瀉的效果觀察[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2021，18（30）：10-14.

[7] KANG Y，CAI Y.Gut microbiota and hepatitis-B-virus-induced chronic liver disease：implications for faecal microbiota transplantation therapy[J].J Hosp Infect，2017，96（4）：342-348.

[8] BAJAJ J S，KAKIYAMA G，SAVIDGE T，et al.Antibiotic-Associated Disruption of Microbiota Composition and Function in Cirrhosis Is Restored by Fecal Transplant[J].Hepatology，2018，68（4）：1549-1558.

[9]郭上齊，武華，翟春寶，等.糞菌移植對營養(yǎng)性肥胖大鼠血脂及腸道屏障的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（4）：25-27，33，169.

[10]劉曼，劉穎，王文成，等.植物固醇對酒精性肝損傷大鼠的保護作用以及對腸道菌群的影響研究[J].營養(yǎng)學報，2019，41（4）：367-373.

[11]張占卿，陸偉，王平安，等.QIAGEN實時PCR與COBASTaqMan檢測血清HBVDNA預(yù)測慢性乙型肝炎肝組織病理狀態(tài)的性能比較[J].肝臟，2016，21（4）：241-247，252.

[12] SHAO T，ZHAO C，LI F，et al.Intestinal HIF-1α deletion exacerbates alcoholic liver disease by inducing intestinal dysbiosis and barrier dysfunction[J].J Hepatol，2018，69（4）：886-895.

[13] WRZOSEK L，CIOCAN D，HUGOT C，et al.Microbiota tryptophan metabolism induces aryl hydrocarbon receptor activation and improves alcohol-induced liver injury[J].Gut，2021，70（7）：1299-1308.

[14] DUNN W，SHAH V H.Pathogenesis of Alcoholic Liver Disease[J].Clin Liver Dis，2016，20（3）：445-456.

[15]何文霞，劉敏，李強，等.糞菌移植在腸道微生態(tài)相關(guān)疾病中的應(yīng)用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2019，28（3）：272-275.

[16] CHEN P，TORRALBA M，TAN J，et al.Supplementation of saturated long-chain fatty acids maintains intestinal eubiosis and reduces ethanol-induced liver injury in mice[J].Gastroenterology，2015，148（1）：203-214.

[17] FUKUI H.Relation of endotoxin， endotoxin binding proteins and macrophages to severe alcoholic liver injury and multiple organ failure[J].Alcohol Clin Exp Res，2005，29（11 Suppl）：172s-179s.

[18]于晨輝，杜仲燕，高佳，等.4-HNE通過抑制TNF-α介導(dǎo)的NF-κB活化誘導(dǎo)酒精性肝損傷[J].中國病理生理雜志，2013，29（6）：1046-1052.

[19] HANCK C，GLATZEL M，SINGER M V，et al.Gene expression of TNF-receptors in peripheral blood mononuclear cells of patients with alcoholic cirrhosis[J].J Hepatol，2000，32（1）：51-57.

[20] OLESEN S W，GURRY T，ALM E J.Designing fecal microbiota transplant trials that account for differences in donor stool efficacy[J].Stat Methods Med Res，2018，27（10）：2906-2917.

[21] IANIRO G，ROSSI E，THOMAS A M，et al.Faecal microbiota transplantation for the treatment of diarrhoea induced by tyrosine-kinase inhibitors in patients with metastatic renal cell carcinoma[J].Nat Commun，2020，11（1）：4333.

[22] YOON Y K，SUH J W，KANG E J，et al.Efficacy and safety of fecal microbiota transplantation for decolonization of intestinal multidrug-resistant microorganism carriage：beyond Clostridioides difficile infection[J].Ann Med，2019，51（7-8）：379-389.

[23] NICOLA S，AMORUSO A，DEIDDA F，et al.Searching for the Perfect Homeostasis： Five Strains of Bifidobacterium longum From Centenarians Have a Similar Behavior in the Production of Cytokines[J].J Clin Gastroenterol，2016，50：s126-s130.

（收稿日期：2021-12-21） （本文編輯：張爽）