王春霞，徐艷梅，蓋成，苗會(huì)娟，畢華，高燕霞

(河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，石家莊 050200)

恩曲他濱屬于新型核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，是近年來開發(fā)的療效較好的治療艾滋病的藥物，對(duì)HIV-1、HIV-2、HBV 均具有抗病毒活性[1-4]。該原料藥的制備過程中使用了甲醇、乙醇、正己烷、四氫呋喃和苯等有機(jī)溶劑，為了控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，應(yīng)對(duì)殘留溶劑進(jìn)行測(cè)定。韓學(xué)靜等采用頂空進(jìn)樣方法同時(shí)測(cè)定上述5 種殘留溶劑的含量[5]，用水作溶劑，采用鹽析的方法，增強(qiáng)難溶于水的組分的響應(yīng)值。鹽析效應(yīng)由于其耐熱性、耐溶劑能力有限，故適用范圍受限。隨著氣相色譜發(fā)展技術(shù)的進(jìn)步，近年來殘留溶劑的測(cè)定一般不采用鹽析的方法，對(duì)于難溶于水的組分，采用一定濃度的有機(jī)溶劑溶解，即解決了溶解分散性問題，又可增強(qiáng)檢測(cè)器上的響應(yīng)值。筆者分別采用頂空進(jìn)樣[6-9]氣相色譜法測(cè)定恩曲他濱中甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯和直接進(jìn)樣[10]氣相色譜法測(cè)定恩曲他濱中的正己烷，既避開了鹽析方法的缺點(diǎn)，又完美地解決了正己烷在高溫下與恩曲他濱中間體生成聚合物導(dǎo)致回收率較低的問題，該方法簡便、靈敏、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，可用于恩曲他濱原料藥中殘留溶劑的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：7890B 型，美國安捷倫科技有限公司。

頂空進(jìn)樣器：7600 型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：XS105 型，感量為0.01 mg，瑞士-梅特勒-托利多公司。

恩曲他濱原料藥：批號(hào)分別為200512、200513、200514、200605，某藥廠提供。

甲醇、乙醇、正己烷、四氫呋喃、苯對(duì)照品：純度分別為99.8%、99.9%、99.8%、99.9%、99.9%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)：色譜純，美國Honeywell 公司。

實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

1.2 溶液制備

恩曲他濱樣品溶液：(A)精密稱取恩曲他濱原料藥0.2 g，置于20 mL 的頂空瓶中，精密加入2 mL 10% DMF 溶液溶解，密封；(B)精密稱取恩曲他濱原料藥約2 g，置于10 mL 容量瓶中，用DMF 溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻。

甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：精密量取苯22.8 μL，置于100 mL 的容量瓶中，用DMF 稀釋至標(biāo)線，搖勻；精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL 的容量瓶中，加入DMF 9 mL，精密加入甲醇378 μL、乙醇633 μL、四氫呋喃81 μL，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯的質(zhì)量濃度分別為3.0、5.0、0.72、0.002 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯混合對(duì)照品溶液：精密量取4 種混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5 mL，置于50 mL的量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為10%的DMF 稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯的質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5、0.72、0.000 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，搖勻。

甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯混合對(duì)照品儲(chǔ)備液20、25、10、5、2、2 mL，分別置于50、100、50、50、25、50 mL 容量瓶中，用10%的DMF 溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。各組分系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度見表1。

正己烷對(duì)照品溶液：精密量取正己烷44.3 μL，置于100 mL 容量瓶中，用DMF 稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成正己烷質(zhì)量濃度為0.29 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取5 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于50 mL 容量瓶中，用DMF 稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成正己烷質(zhì)量濃度為0.029 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

甲醇、乙醇、四氫呋喃、正己烷、苯混合對(duì)照品溶液：精密量取甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL 和正己烷對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置于50 mL 量瓶中，加10% DMF 溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻。

正己烷系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取正己烷對(duì)照品溶液20、25、10、5、3、2 mL，分別置于50、100、50、50、50、50 mL 容量瓶中，用DMF 稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成正己烷系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度見表1。

表1 5 種組分的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

1.3 色譜條件

色譜柱：DB-1 毛細(xì)管柱(50 m×0.53 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min 的速率升至180 ℃，保持1 min；載氣：氮?dú)猓髁繛?.0 mL/min，恒流；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測(cè)器溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；進(jìn)樣體積：1.0 mL(頂空進(jìn)樣)，1.0 μL(直接進(jìn)樣)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 頂空進(jìn)樣色譜法測(cè)定甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯

精密量取甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯混合對(duì)照品溶液和恩曲他濱樣品溶液各2 mL，置于20 mL 頂空瓶中，頂空平衡溫度為80 ℃，頂空平衡時(shí)間為30 min，分別精密量取頂空瓶上部氣體1 mL 注入氣相色譜儀，按1.3 色譜條件測(cè)定，以色譜峰面積外標(biāo)法定量。

1.4.2 直接進(jìn)樣色譜法測(cè)定正己烷

精密量取正己烷對(duì)照品溶液和恩曲他濱樣品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按1.3 色譜條件測(cè)定，以色譜峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇及色譜條件

選用強(qiáng)極性HP-INNOWax 毛細(xì)管柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明乙醇與苯分離欠佳；選用DB-1 毛細(xì)管柱(50 m×0.53 mm，5 μm)，可使甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯和正己烷5 種殘留溶劑有效分離，避免了溶劑的干擾，采用程序升溫提高了分離效率，縮短了分析時(shí)間。

2.2 進(jìn)樣方式的選擇

頂空進(jìn)樣技術(shù)可以避免繁瑣的樣品處理過程，避免有機(jī)溶劑對(duì)分析造成的干擾，減少對(duì)色譜柱及進(jìn)樣口的污染，可有效提高苯的響應(yīng)值。由于苯的ICH (國際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì))規(guī)定限度[11-14]很小，在直接進(jìn)樣色譜系統(tǒng)中，其色譜峰響應(yīng)值較小，故采用頂空進(jìn)樣法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，頂空溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為30 min 時(shí)，頂空瓶中氣液兩態(tài)達(dá)到最大飽和狀態(tài)，故選擇頂空平衡溫度為80℃，平衡時(shí)間為30 min。

曾嘗試在頂空氣相色譜系統(tǒng)中同時(shí)測(cè)定甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯和正己烷5 種殘留溶劑的殘留量，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正己烷的回收率特別低，平均回收率為23.6%。查閱生產(chǎn)工藝流程發(fā)現(xiàn)，其原因是正己烷與恩曲他濱某個(gè)中間體在頂空預(yù)熱過程中發(fā)生聚合反應(yīng)。為了解決正己烷回收率低問題，用直接進(jìn)樣法測(cè)定正己烷，且直接進(jìn)樣法色譜條件與頂空色譜系統(tǒng)一致，采用N，N-二甲基甲酰胺為溶解介質(zhì)，回收率為90.4%，結(jié)果滿意。

2.3 溶解介質(zhì)的選擇

由于正己烷和苯難溶于水，不能在水中完全均勻分散；而用DMF 作溶解介質(zhì)時(shí)，苯與DMF 完全互溶，其分子間結(jié)合力較強(qiáng)，頂空加熱過程中苯難以溢出，故苯的色譜峰響應(yīng)值非常低[15-20]。為兼顧溶解性和靈敏度，試驗(yàn)中曾考察了5% DMF、10%DMF、15% DMF、20% DMF、25% DMF、50% DMF六種溶液作溶解介質(zhì)，結(jié)果表明：10% DMF 溶液作為溶解介質(zhì)最佳，苯的響應(yīng)值較大，因此選擇10%DMF 作為溶解介質(zhì)。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取恩曲他濱樣品6 份，按照1.2 方法制備恩曲他濱樣品溶液，分別在0、1、2、4、6、8 h 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分色譜峰面積，結(jié)果列于表2。由表2 可知，甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯、正己烷5 種溶劑色譜峰面積測(cè)定值的相對(duì)偏差分別為0.2%、0.1%、0.2%、2.8%、1.3%，表明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.5 色譜圖

(1)取10% DMF 溶劑空白溶液和甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯、正己烷混合對(duì)照品溶液，用頂空法分別進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖分別如圖1、圖2 所示。

圖1 10% DMF 溶劑空白溶液色譜圖

圖2 甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯混合對(duì)照品溶液色譜圖

由圖1、圖2 可知，溶劑(N，N-二甲基甲酰胺)對(duì)主要成分的測(cè)定無干擾，且4 種有機(jī)溶劑成分之間分離良好，色譜峰形狀尖銳、對(duì)稱，易于定量。

(2)取正己烷對(duì)照品溶液、恩曲他濱加標(biāo)樣品溶液和10% DMF 溶劑空白溶液，直接進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖分別如圖3～圖5 所示。由圖3～圖5 可知，溶劑DMF 及其它4 種成分對(duì)正己烷的測(cè)定無干擾，且正己烷色譜峰形狀尖銳、對(duì)稱，易于定量。

圖3 正己烷對(duì)照品溶液色譜圖

圖4 恩曲他濱樣品加標(biāo)溶液

圖5 10%DMF 溶劑空白溶液色譜圖

2.6 線性關(guān)系與檢出限

(1)分別精密量取1.2 中配制的甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液2 mL，置于20 mL 頂空瓶中，在1.3 色譜條件下測(cè)定，以甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得線性方程、相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯4 種組分的線性關(guān)系

(2)在1.3 色譜條件下測(cè)定1.2 中配制的正己烷系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以正己烷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得線性方程為Y=6.631 2X+3.456 5、線性范圍為0.011 59～0.115 9 mg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

2.7 定量限與檢出限

取空白加標(biāo)樣品溶液，逐步稀釋并測(cè)定，以信噪比為3 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限，以信噪比為10 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限。甲醇、乙醇、四氫呋喃和苯的檢出限分別為0.6、1.0、1.4、0.4 ng/mL；定量限分別為1.9、3.1、4.3、1.3 ng/mL。正己烷的檢出限為8.7 ng/mL，定量限為26.2 ng/mL。

2.8 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取恩曲他濱樣品6 份，按照1.2 方法制備恩曲他濱樣品溶液，測(cè)定樣品中5 種有機(jī)溶劑的本底含量；然后向6 份樣品中分別加入甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯混合對(duì)照品溶液、正己烷對(duì)照品溶液適量，同法制備樣品溶液并測(cè)定，計(jì)算5 種有機(jī)溶劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表4。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4

由表4 可知，甲醇、乙醇、四氫呋喃、苯和正己烷的樣品加標(biāo)回收率為97.9%～99.0%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～0.7%(n=9)，說明該方法精密度、準(zhǔn)確度滿足分析要求。

3 結(jié)語

采用兩種進(jìn)樣方式檢測(cè)恩曲他濱原料中的5 種殘留溶劑的含量，該方法靈敏度高，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，解決了正己烷在頂空系統(tǒng)中與恩曲他濱中間體在預(yù)熱過程中發(fā)生聚合反應(yīng)而導(dǎo)致回收率低的問題，也為以后各原料藥殘留溶劑的測(cè)定提供了更為謹(jǐn)慎的方法學(xué)驗(yàn)證思路，在了解工藝的基礎(chǔ)上盡可能探索更為科學(xué)的殘留溶劑測(cè)定方法。