寧東元，李海強(qiáng)，韋正，潘立衛(wèi)，黃秀香

(河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300)

0 引言

鋅在人體中屬于微量元素，但是從承擔(dān)的生理功能來看，鋅在維持人的機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)方面扮演著重要角色[1-2]：鋅離子是人體許多重要蛋白或輔酶的組成部分，如碳酸酐酶和鋅指蛋白；更有著“智力元素”和“生命之花”的美譽(yù)，調(diào)控人的大腦發(fā)育和生殖功能。但是人攝入過量的鋅后會(huì)打亂鋅與銅、鐵、硒等其他微量元素的動(dòng)態(tài)平衡[3]，引起心腦血管疾病和抵抗力下降，同樣不利于健康。由于汽車和電池工業(yè)的日益發(fā)展，含鋅合金的大量生產(chǎn)與應(yīng)用不可避免地造成了鋅的污染，開發(fā)一種能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)環(huán)境或生物樣本的鋅含量的方法具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[4-5]。目前已有的鋅離子含量的檢測(cè)手段包括了原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等，但是儀器價(jià)格過于昂貴，樣品制備和檢測(cè)步驟繁瑣制約了它們的應(yīng)用；相比之下，鋅離子熒光探針法以其價(jià)廉方便同時(shí)可實(shí)現(xiàn)精確定量的在線檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，得到了學(xué)界的廣泛關(guān)注[6]。

聯(lián)萘酚衍生物具有兩個(gè)富電子的萘環(huán)，以其量子產(chǎn)率高，可修飾位點(diǎn)多，可具有C1 或者C2 兩種軸手性形式等優(yōu)點(diǎn)成為熒光探針中的重要骨架結(jié)構(gòu)。其中，C2 對(duì)稱軸的聯(lián)萘酚席夫堿衍生物以其手性軸對(duì)稱的特殊空間構(gòu)型，可引入的配位點(diǎn)多，與金屬離子螯合性能強(qiáng)的特點(diǎn)，在金屬離子熒光探針中占據(jù)著重要的地位[7-8]。本文即合成了一個(gè)C2 對(duì)稱軸聯(lián)萘酚亞胺類衍生物鋅離子探針(S)-2，并初步探究了其對(duì)鋅離子的識(shí)別的最優(yōu)條件與機(jī)制。

1 儀器與試劑

LAMBDA750S 紫外/可視/近紅外分光光度計(jì)(美國Perkin-Elmer 公司)，LS-55 型熒光光譜儀(美國Perkin-Elmer 公司)；Bruker 400 MHz 型核磁共振譜儀(瑞士Bruker 公司)，超高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo-Fisher Scientif ic 公司)。

本文所用金屬離子鹽除鋅源使用乙酸鋅外，其余金屬離子鹽均為硝酸鹽或氯化物，合成所需試劑，分析試劑均購自上海泰坦科技股份有限公司。

2 熒光探針(S)-2 的合成

稱取3,3’- 二甲酰基-(S)- 聯(lián)萘酚(0.75 mmol，257.2 mg) 和(1S,2R)-2- 氨 基-1,2- 二 苯 基 乙 醇 (1.57 mmol，336.5 mg) 置于50 mL 圓底燒瓶 中，加入干燥的二氯甲烷20 mL，裝置用氮?dú)獗Ｗo(hù)，升溫至42 ℃攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸移除溶劑，再用乙醇對(duì)殘?jiān)M(jìn)行重結(jié)晶，抽濾得到亮黃色固體粉末(S)-2 480.9 mg，收率為89.10%。

探針經(jīng)核磁與高分辨質(zhì)譜表征的數(shù)據(jù)為：1HNMR(400 MHz，CDCl3) δ12.85(s, 2H),8.25(s, 2H), 7.83～7.77(m, 4H), 7.41～7.17(m, 12H), 5.29(s, 2H), 4.99(dd, J=7.4Hz, 2.2Hz, 1H), 4.45(d,J=7.4 Hz,2H).13CNMR(100 MHz,DMSO-d6) δ166.29, 154.74, 142.44, 140.81, 135.00, 133.98, 129.50, 128.64, 128.48, 128.42, 127.78, 127.66, 127.60, 127.55, 124.67, 123.69, 121.03, 116.44, 79.62, 77.27, 67.50. HRMS (ESI+) Calcd. For C50H41N2O4[M+H+]: 733.6088, Found: 733.6088。

3 樣品溶液配制與測(cè)試方法

將(S)-2 溶于色譜純四氫呋喃，各種常見金屬離子鹽用色譜甲醇溶解，均配置成濃度2×10-3M 的儲(chǔ)備液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，配制熒光測(cè)試樣品時(shí)，先取計(jì)算量的(S)-2 儲(chǔ)備液和金屬離子儲(chǔ)備液在5 mL 容量瓶中混合均勻，再用色譜甲醇定容。等摩爾連續(xù)變化法實(shí)驗(yàn)中，在樣品中(S)-2 與Zn2+的總濃度保持為2×10-5M，在其余實(shí)驗(yàn)中，(S)-2 在樣品中的濃度保持為2×10-5M，熒光測(cè)試的條件為激發(fā)光波長280 nm，入射狹縫/發(fā)射狹縫：5/5 nm。配制質(zhì)譜測(cè)試樣品時(shí)，將1 mL(S)-2 儲(chǔ)備液與1.5 mL 的Zn(OAc)2儲(chǔ)備液混合，用色譜甲醇稀釋至5 mL。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 熒光探針(S)-2 可選擇性識(shí)別Zn2+

在280 nm 激發(fā)光作用下，(S)-2 自身由于PET效應(yīng)幾乎不發(fā)出熒光，將等量的(S)-2 與各種金屬離子作用后，如圖1 所示，Zn2+與(S)-2 作用后能使得(S)-2 在514.5 nm 附近產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)烈的熒光發(fā)射峰(I/I0可高達(dá)400 倍以上)。在其余金屬離子中，絕大部分對(duì)(S)-2 的熒光強(qiáng)度沒有任何影響，僅Al3+和Cd2+能輕微增強(qiáng)(S)-2 的熒光，強(qiáng)度也不到Zn2+與(S)-2 作用的5%(510 a.u. vs 18.4 a.u.&16.2 a.u.), (S)-2 是一種具有高度選擇性的Zn2+熒光探針。

圖1 (S)-2 對(duì)Zn2+的選擇性識(shí)別

4.2 熒光探針(S)-2 識(shí)別Zn2+的條件優(yōu)化與抗干擾能力研究

鑒于(S)-2 對(duì)Zn2+有較好的識(shí)別效果，分別進(jìn)行了主客體結(jié)合比和反應(yīng)時(shí)間的探索，期望找到該熒光探針對(duì)Zn2+熒光響應(yīng)的最佳條件，并在此條件研究下其他常見金屬離子對(duì)(S)-2 識(shí)別Zn2+的干擾作用。

等摩爾連續(xù)變化法是研究主客體結(jié)合比的有效方法，(S)-2 與Zn2+作用的Job’s plot(圖2(a))，Zn2+的摩爾比在0.6 時(shí)，熒光強(qiáng)度較高(即(S)-2 與Zn2+濃度比為2:3)，采用滴定法對(duì)這一推論做了進(jìn)一步的驗(yàn)證，并研究在Zn2+濃度在最佳結(jié)合比之下時(shí)，(S)-2 與Zn2+作用后在λ=514.5 nm 處的熒光強(qiáng)度是否與Zn2+濃度有線性關(guān)系，結(jié)果如圖2(b)和圖2(c)所示，Zn2+當(dāng)量在1.5 eq 以下時(shí)，λ=514.5 nm 處的熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性上升，對(duì)滴定實(shí)驗(yàn)的多組平行數(shù)據(jù)做線性擬合計(jì)算，可得Zn2+濃度與熒光強(qiáng)度的回歸方程為y=26.693x+11.184，R2達(dá)到0.994，線性度良好，利用公式LOD=3 s/k 可得出(S)-2 檢測(cè)Zn2+的檢測(cè)限為9.97 nm，Zn2+濃度達(dá)到1.5 eq 以后，熒光強(qiáng)度基本處于同一水平，故而我們可認(rèn)為(S)-2 與Zn2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的結(jié)合比為2∶3，而且在9.97 nM～30 μM 的濃度范圍內(nèi)，(S)-2 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Zn2+的定量檢測(cè)?；诖私Y(jié)果，繼續(xù)研究(S)-2 與1.5 eq Zn2+作用的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系的結(jié)果如圖2(d)所示，在設(shè)置的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)(10～180 min), 樣品的熒光強(qiáng)度始終保持同一水平，這說明(S)-2 與Zn2+的反應(yīng)十分迅速，在10 min 內(nèi)即達(dá)到平衡并且能長時(shí)間維持穩(wěn)定。(S)-2對(duì)Zn2+有實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)的潛力。

圖2 (S)-2 對(duì)Zn2+的識(shí)別條件優(yōu)化

在前述實(shí)驗(yàn)中探索出的對(duì)Zn2+的最佳識(shí)別條件下，我們采用競爭性實(shí)驗(yàn)研究其他常見離子對(duì)(S)-2識(shí)別Zn2+的干擾，結(jié)果如圖3 所示。加入Al3+會(huì)導(dǎo)致(S)-2 與Zn2+作用產(chǎn)生的熒光完全猝滅，F(xiàn)e3+、Pb2+、Cd2+也會(huì)明顯影響(S)-2 與Zn2+的作用，而其他離子對(duì)(S)-2 識(shí)別Zn2+幾乎沒有干擾，考慮到競爭實(shí)驗(yàn)中干擾離子與Zn2+是等量的，但是干擾離子在環(huán)境或生物樣本中相對(duì)于Zn2+含量較低，(S)-2 仍具有實(shí)際應(yīng)用的潛力。

4.3 探針識(shí)別Al3+的機(jī)制研究

圖3 常見金屬離子對(duì)(S)-2 識(shí)別Zn2+的干擾作用

(S)-2 與Zn2+結(jié)合比的最直觀證據(jù)是(S)-2 與Zn2+生成的配合物的晶體結(jié)構(gòu)，在無法獲得晶體的情況下，高分辨質(zhì)譜可從側(cè)面證明配合物的存在，(S)-2 與Zn2+反應(yīng)后的質(zhì)譜譜圖可見一組827.673 3、827.172 7 附近，峰間距為0.5 左右的多重質(zhì)譜峰，與[2(S)-2+3Zn]2+的質(zhì)荷比計(jì)算值827.676 5、827.174 8高度吻合。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]，對(duì)[2(S)-2+3Zn]2+的可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行了建模(如圖4 所示)并推測(cè)識(shí)別機(jī)制：三個(gè)Zn2+可以與兩個(gè)(S)-2 分子形成3+2 鰲合離子，其中一個(gè)Zn2+同時(shí)與兩個(gè)(S)-2 上的相鄰的酚羥基與亞胺基團(tuán)鰲合，另外兩個(gè)Zn2+則分別與同一個(gè)(S)-2上剩余的鰲合位點(diǎn)結(jié)合，所有Zn2+均是四配位結(jié)構(gòu)。對(duì)于(S)-2 來說，同側(cè)的酚羥基與亞胺氮原子有可能形成分子內(nèi)氫鍵伴隨質(zhì)子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生a-PET 效應(yīng)，導(dǎo)致(S)-2 自身并沒有熒光，當(dāng)Zn2+與(S)-2 發(fā)生鰲合反應(yīng)后，原有的分子內(nèi)氫鍵被破壞，質(zhì)子轉(zhuǎn)移效應(yīng)消失，(S)-2 占據(jù)HOMO 軌道的電子進(jìn)入[Zn3((S)-2)2]2+的配位鍵，而LUMO 軌道的電子在激發(fā)態(tài)下可順利進(jìn)入HOMO 軌道，使得a-PET 效應(yīng)受阻，形成CHEF(鰲合致熒光增強(qiáng))效應(yīng)。

圖4 (S)-2 與Zn2+可能的結(jié)合模式

5 結(jié)語

本文設(shè)計(jì)并合成對(duì)Zn2+具有良好識(shí)別效果的聯(lián)萘酚亞胺類熒光探針(S)-2，(S)-2 在λ=280 nm 的激發(fā)條件下自身不發(fā)出熒光，但是與Zn2+發(fā)生配位反應(yīng)后由于CHEF 效應(yīng)可在λ=514.5 nm 附近出現(xiàn)強(qiáng)熒光發(fā)射峰；通過等摩爾連續(xù)變化法確定了(S)-2 與Zn2+作用的結(jié)合比為2:1，滴定實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)合比，還證明了在Zn2+的濃度范圍為9.97 nM～30 μM之間時(shí)，與(S)-2 作用的Zn2+濃度與兩者作用后在λ=514.5 nm 處的熒光強(qiáng)度呈顯著的線性關(guān)系，回歸方 程為y=26.693x+11.184，(S)-2 與Zn2+結(jié)合 迅 速，10 min 內(nèi)即可達(dá)到平衡，在3 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，在最佳的識(shí)別條件下，Al3+對(duì)(S)-2 的識(shí)別作用有明顯干擾。高分辨質(zhì)譜證明了[Zn3((S)-2)2]2+的存在，也佐證了(S)-2 識(shí)別Zn2+的機(jī)制。(S)-2 有望發(fā)展成可用于實(shí)際Zn2+檢測(cè)工作的熒光探針。