婁 妍，余 旭，孫心怡，繆鋆鋆，徐巍龍，查 敏

江蘇省中醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

研究[1］表明，2 型糖尿病患者近20%合并骨質(zhì)疏松，由于該類患者普遍合并神經(jīng)病變等高風(fēng)險(xiǎn)因素，加之骨組織纖維結(jié)構(gòu)的改變，骨骼脆性增加，骨折的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較正常人群顯著增高。2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松患者最常發(fā)生骨折的部位為胸腰椎、橈骨遠(yuǎn)端、足踝和髖關(guān)節(jié)，均為人體負(fù)重結(jié)構(gòu)，一旦發(fā)生骨折則將較長(zhǎng)時(shí)間喪失勞動(dòng)能力。此外，該類患者常存在手術(shù)切口不愈合、感染等并發(fā)癥，給臨床治療帶來難題。芪葵顆粒是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探究芪葵顆粒對(duì)2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠糖脂代謝指標(biāo)的干預(yù)作用，同時(shí)探究芪葵顆粒對(duì)大鼠MSCs 分化的誘導(dǎo)方向，以期為臨床治療2型糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性SD大鼠18只，體質(zhì)量200～250 g，12周齡，購(gòu)于南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-2019-0106。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)。本研究由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥品及試劑芪葵顆粒由江蘇省中醫(yī)院藥房提供。鏈尿佐菌素（Biosharp 公司，批號(hào)：BS185）；地塞米松磷酸鈉注射液（湖北藥業(yè)有限公司，批號(hào)：50-02-2，規(guī)格：5 mg/支）；青霉素G（利康藥業(yè)，批號(hào)：61-33-6，規(guī)格：80 萬U/支）；慶大霉素（利康藥業(yè)，批號(hào)：1403-66-3，規(guī)格：8 萬U/支）；胎牛血清（Gibco，規(guī)格：500 mL/瓶）；L-DMEM 培養(yǎng)基（Cyagen公司）；SD大鼠BMSC成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Cyagen 公司）；蘇木素、伊紅（四季青公司）；茜素紅、油紅O 染液、噻唑藍(lán)、DMSO、Percoll、BGP 及B-ALP 試劑盒（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器37XC 型倒置相差顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；JB-P5 型石蠟包埋及脫水機(jī)（武漢俊杰電子公司）；RM2016 型石蠟超薄切片機(jī)（武漢俊杰電子公司）；Image-pro plus 6.0（IPP）；恒溫恒濕孵育箱（Heraeus）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模及分組 將18只雌性SD大鼠隨機(jī)分為假造模組、模型對(duì)照組及治療組，每組6 只。假造模組進(jìn)行假手術(shù)并注射等量生理鹽水。模型對(duì)照組及治療組使用卵巢切除術(shù)+鏈尿佐菌素（streptozotocin，STZ）的方法進(jìn)行造模?？崭寡牵?6.7 mmol/L，默認(rèn)為造模成功。

1.4.2 干預(yù)方法 芪葵顆粒灌胃劑型制備方法：芪葵顆粒根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積等效量換算比率計(jì)算給藥劑量為：2.7 g/kg。治療組造模后每日予芪葵顆粒，假造模組、模型對(duì)照組給予等量生理鹽水，共干預(yù)3周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血糖、血脂、體質(zhì)量及骨密度測(cè)定 造模及干預(yù)完成后，測(cè)定各組大鼠血糖（glucose，Glu）、體質(zhì)量（body weight，BW）、甘油三酯（triglyceride，TG）、骨密度（bone mineral density，BMD）值。

1.5.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng) 將各組大鼠股骨近端髓腔直接在無菌條件下放于L-DMEM培養(yǎng)基中沖洗，沖出的骨髓細(xì)胞懸液離心半徑30 cm，1000 r/min 離心10 min，棄上清、脂肪及雜質(zhì)，加入少量DMEM 重懸，沿離心管壁緩慢滴入含等量體積的Percoll（密度為1.073 g/mL）分離液中，離心半徑30 cm，1500 r/min 離心10 min。取中間云霧狀細(xì)胞層置于另一離心管中，PBS沖洗2次后把得到的有核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，換液3 次后MSCs 則得以純化。采用配制而成的L-DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素），將純化的MSCs以1×104/cm2的濃度接種于該培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1 次，細(xì)胞達(dá)90%融合后以0.25%胰蛋白酶消化，各組傳代前凍存部分原代細(xì)胞備用。

1.5.3 茜素紅染色鈣礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù) 使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)各組MSCs 進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)18 天，以Tris-Hcl 配制茜素紅溶液至pH 4.0 染色30 min，200倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，對(duì)紅染鈣礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5.4 油紅O染色脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù) 使用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)各組傳代一次的MSCs 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)12天。油紅O 染液浸染30 min，蘇木素染液浸染1 min，200 倍鏡下隨機(jī)選取6 個(gè)視野，對(duì)紅染脂肪細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5.5 BGP及B-ALP定量 各組MSCs按1×104/孔接種在36孔板上，每組6孔，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)2周，使用B-ALP ELASA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，將各組上清吸取約50 μL，加入樣本孔，而后加入HRP100 μL，37℃孵育60 min，棄去液體，拍干，洗滌液洗滌，反復(fù)5次。每孔加入底物50 μL，37℃避光孵育15 min，每孔加入終止液KOH 50 μL，酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)的OD值。

1.5.6 MTT測(cè)定吸光度值 取各組BMSCs0.25%胰蛋白酶消化，以5×103/孔接種于96 孔板后移入37℃、5%CO2、飽和濕度標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10天，分別于第1、3、5、7、10天加入MTT（5 g/L）20 μL/孔，4 h 后每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用xˉ±s表示，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，LSD 法進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖、血脂、體質(zhì)量及骨密度與模型對(duì)照組比較，治療組血糖降低、骨密度增高（P＜0.05）；體質(zhì)量、甘油三酯兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血糖、血脂、體質(zhì)量及骨密度比較（xˉ±s）

2.2 鈣結(jié)節(jié)及脂肪結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)治療組與假造模組茜素紅染色均可見大量礦化的鈣結(jié)節(jié)，兩組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示骨新生活躍。而模型對(duì)照組礦化鈣結(jié)節(jié)數(shù)目較少，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療組及假造模組均可見少量紅染脂肪細(xì)胞，數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而模型對(duì)照組脂肪細(xì)胞數(shù)顯著多于其他兩組（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 各組大鼠鈣結(jié)節(jié)及脂肪結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)比較（xˉ±s） 個(gè)/HP

2.3 BGP 及B-ALP 定量各組BMCSs 成骨誘導(dǎo)后，模型對(duì)照組BGP及B-ALP含量均顯著低于假造模組（P＜0.05），而芪葵顆粒組的BGP及B-ALP水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 MTT 測(cè)定以假造模組為參照，模型對(duì)照組各時(shí)間段OD450 比值均顯著降低（P＜0.05），治療組OD450 比值均顯著較模型組提高（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

在本研究中，造模后大鼠與假造模組相比，呈現(xiàn)典型的糖脂紊亂現(xiàn)象及顯著的骨質(zhì)疏松表現(xiàn)，表現(xiàn)為血糖升高，體質(zhì)量增加，同時(shí)骨密度顯著降低。給予芪葵顆粒干預(yù)后，模型大鼠的血糖顯著降低，骨密度顯著升高，體質(zhì)量及甘油三酯未見明顯改善，可能與研究干預(yù)周期較短有關(guān)。為進(jìn)一步明確芪葵顆粒干預(yù)2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松的效用機(jī)理，我們對(duì)各組大鼠股骨髓腔MSCs 進(jìn)行了培養(yǎng)及成骨成脂誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示，芪葵顆粒能顯著誘導(dǎo)MSCs 向成骨方向分化，促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成，同時(shí)降低MSCs 向脂肪方向分化，干預(yù)MSCs 的效應(yīng)明顯。同時(shí)，通過ELISA 研究證實(shí)，芪葵顆粒能顯著提高成骨誘導(dǎo)關(guān)鍵蛋白BGP 及B-ALP 表達(dá)水平。此外，MTT 實(shí)驗(yàn)證實(shí)芪葵顆粒還能顯著提高M(jìn)SCs的傳代和增殖活性，保持細(xì)胞干性。

流行病學(xué)研究顯示，糖尿病患者較健康人群同年齡段合并骨質(zhì)疏松的比例顯著增高[2］。研究[3］發(fā)現(xiàn)，隨著2 型糖尿病患者病程的延長(zhǎng)，骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)將增加1.7～2.2 倍。醫(yī)學(xué)界認(rèn)為，糖尿病微血管病變可使各處骨小梁出現(xiàn)微血管循環(huán)障礙，產(chǎn)生缺血缺氧病理改變，致使骨密度降低導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[4］。除較為宏觀的血運(yùn)因素外，代謝組學(xué)方面的改變也在2 型糖尿病患者并發(fā)骨質(zhì)疏松過程中發(fā)揮了重要作用，高糖高滲透壓可導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物增加[5］，而糖基化終末產(chǎn)物的不斷蓄積被證實(shí)可抑制MSCs 向成骨細(xì)胞的分化，并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞形成，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生[6］。因此，改善MSCs細(xì)胞分化，有助于干預(yù)2型糖尿病并發(fā)的骨質(zhì)疏松。

芪葵顆粒主方由生黃芪、制首烏和黃蜀葵花等中藥組成[7］，是江蘇省中醫(yī)院經(jīng)典制劑，長(zhǎng)期用于2 型糖尿病的早期干預(yù)和并發(fā)癥的治療。方中黃芪甘溫、補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)止渴、利水消腫[8-9］；制首烏補(bǔ)血養(yǎng)精、滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)虛而不滋膩[10］，二藥配用，補(bǔ)益先天之本與后天之本，調(diào)氣補(bǔ)血并重；配以黃蜀葵花，活血利尿消腫，補(bǔ)瀉同施，標(biāo)本兼顧[11］。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)圖譜，方劑的主要效用成分超過20 種，包括金絲桃苷、槲皮素、黃芪甲苷、二苯乙烯苷等。其中金絲桃苷及槲皮素具有顯著的抗骨質(zhì)疏松作用[12］。

綜上所述，本研究初步證實(shí)，芪葵顆粒除能顯著改善2 型糖尿病血糖指標(biāo)外，還能有效干預(yù)糖尿病性骨質(zhì)疏松，具有良好的臨床應(yīng)用前景和進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。