王建梅，王國(guó)盼，陸安靜，秦 琳，魯艷柳，白朝鈞，何芋岐，譚道鵬

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州金釵石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)工程研究中心，貴州 遵義 563099；2.貴州納蒂爾生物科技有限公司，貴州 遵義 563000)

細(xì)菌進(jìn)化選擇是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因，而近些年抗生素的濫用更加劇了耐藥菌的產(chǎn)生，為臨床用藥有效性及安全性帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)[1]。金黃色葡萄球菌是自然界分布最廣泛的革蘭氏陽(yáng)性球菌之一，也是引起疾病最重要的致病菌之一；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)抗生素均耐藥，并可能對(duì)氨基糖苷類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥[2]。大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)、銅綠假單胞菌(PA)和肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae,Kleb)也是臨床較為常見(jiàn)的條件致病菌，均有嚴(yán)重的多重耐藥性[3]。由于抗生素和抗菌藥物的廣泛使用，耐藥菌現(xiàn)象的產(chǎn)生無(wú)法避免。中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)人與自然的統(tǒng)一關(guān)系，并具有多靶點(diǎn)和多成分等特點(diǎn)。因此，從來(lái)源廣泛的中藥材中尋找安全有效的天然抑菌劑成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。臨床上常用于“胃陰不足，病后虛熱不退，熱病津傷，骨蒸勞熱，食少干嘔，陰虛火旺，目暗不明，口干煩渴，筋骨痿軟”等癥[4]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛具有抗血栓[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、抗衰老[8]等多種藥理作用[9]。金釵石斛生長(zhǎng)于陰暗潮濕的山間林下，在這種微生物豐富自然環(huán)境脅迫下，金釵石斛產(chǎn)生出較強(qiáng)的抵御微生物能力。為此，本文通過(guò)對(duì)不同極性部位金釵石斛提取物的體外抑制金黃色葡萄球菌等5種耐藥菌的活性評(píng)價(jià)，比較金釵石斛不同極性部位提取物的抑菌效果，為今后開(kāi)發(fā)以金釵石斛為原料的天然抑菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC700603、大腸桿菌ATCC25922，由遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基 MH肉湯培養(yǎng)基(青島日水生物技術(shù)有限公司)、瓊脂粉(biosharp)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(上海泰坦科技股份有限公司)、二甲基亞砜(北京綠澤生物技術(shù)有限公司貴州分公司)

金釵石斛藥材采自貴州省赤水市，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院吳發(fā)明副教授鑒定為金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)的莖。

1530酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo 公司)，XFH-50CA電熱式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，MJX-150生化培養(yǎng)箱(金壇市城東新瑞儀器廠)，VD-650桌上型(垂直送風(fēng))凈化工作臺(tái)(上海尚道儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金釵石斛不同極性部位的制備 稱(chēng)取干燥的金釵石斛藥材50 g，置2 000 mL圓底燒瓶中，按1∶12的固液比加入蒸餾水，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，靜置冷卻，過(guò)濾，濾液減壓濃縮成浸膏狀，置烘箱干燥，作為水提物(WE)；再稱(chēng)取金釵石斛藥材200 g，置于5000 mL圓底燒瓶，以1∶12的固液比，加入70%乙醇溶液2 400 mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過(guò)濾，濃縮至浸膏狀。取一部分浸膏干燥，作為乙醇提取物(EE)；剩余部分用加熱至50 ℃左右的蒸餾水100 mL使其均勻分散，依次用100 mL的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，分別萃取3次[10]，合并萃取液后，經(jīng)減壓濃縮、干燥，得石油醚部位(PE)、乙酸乙酯部位(EAE)和正丁醇部位(BE)提取物，將以上5種金釵石斛提取物分別密封放置于4℃冰箱[11]，備用。

1.2.2 供試液的制備 記錄不同極性部位金釵石斛提取物質(zhì)量，分別精密稱(chēng)取1.20 g用6.00 mL二甲基亞砜溶液(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，混合均勻，得到200 mg/mL的不同極性部位的金釵石斛供試液。

1.2.3 培養(yǎng)基的配置 MH肉湯培養(yǎng)基：取MH培養(yǎng)基粉末22.00 g，精密稱(chēng)定，加三蒸水均勻攪拌至充分溶解，定容至500 mL，置121 ℃ 電熱式壓力蒸汽滅菌器中，高壓滅菌30 min，冷卻至室溫，置4 ℃冰箱，密封保存，備用。

MH瓊脂培養(yǎng)基：每100 mL MH液體培養(yǎng)基中加入2～3 g瓊脂粉，置121 ℃ 電熱式壓力蒸汽滅菌器中，高壓滅菌30 min，冷卻至45 ℃倒入瓊脂培養(yǎng)皿平板，凝固后，密封置4 ℃冰箱保存[12]，備用。

1.2.4 菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 實(shí)驗(yàn)前，生物安全柜紫外照射30 min; 將凍存的金黃色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、大腸埃希氏菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(PA)、肺炎克雷伯菌(Kleb)復(fù)蘇，采用平板劃線法接種在MH瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h；挑取MH瓊脂培養(yǎng)基上單個(gè)菌落于裝有適量MH肉湯培養(yǎng)基的離心管中37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)8 h至菌液渾濁；分別取0、50、100、150、200、250、300、350 μL菌液，用MH肉湯培養(yǎng)基定容至1 000 μL，混勻后用酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)定光密度(OD)；將系列不同濃度菌懸液進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?0-6稀釋液0.1 mL置于瓊脂培養(yǎng)皿，均勻涂布，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿上菌落數(shù)，平行重復(fù)3次，計(jì)算均值，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)菌落數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制各個(gè)耐藥菌標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1。

1.2.5 菌液制備 參考文獻(xiàn)[13]方法，菌種復(fù)蘇后劃線接種于MH瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)分別挑取MH瓊脂培養(yǎng)基上單個(gè)菌落于適量 MH肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下，振蕩至菌液渾濁。分別吸取各個(gè)菌懸液200 μL于96孔無(wú)菌培養(yǎng)板內(nèi)，迅速放置酶標(biāo)儀中,600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各培養(yǎng)孔OD值。根據(jù)測(cè)得的OD值代入標(biāo)曲，計(jì)算得到菌落數(shù)，稀釋細(xì)菌濃度至5×104cfu/mL，即為實(shí)驗(yàn)菌懸液。

1.2.6 最小抑菌濃度的測(cè)定 參考Carla Araya-Cloutier等[14]報(bào)道的方法，采用二倍微孔稀釋法，測(cè)定不同極性部位金釵石斛提取物對(duì)SA、MRSA、PA、Kleb、E.coli五種供試菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。將制備好的供試藥液依次取1 mL加入1 mL無(wú)菌水系列倍比稀釋?zhuān)貌煌瑵舛鹊南盗袠悠啡芤篬10]。取菌懸液,稀釋至濃度約為3×105cfu/mL,接種于96孔無(wú)菌培養(yǎng)板內(nèi)。第1-5列每孔均加入180 μL菌懸液和20 μL供試藥液,第6列每孔加入MH肉湯培養(yǎng)基,第7列每孔加入200 μL菌懸液；另取50 μL供試藥液同法操作。均置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后,觀察渾濁程度。部分供試液存在顏色，吸取菌懸液和供試藥液，均勻涂布到瓊脂平板培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h，鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。觀察菌落生長(zhǎng)情況，以不生長(zhǎng)菌落的最高藥物稀釋濃度為藥物的最小抑菌濃度(MIC)。平行3次試驗(yàn)，以3次結(jié)果相近為標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.2.7 抑菌活性測(cè)定 在已紫外30 min的生物安全柜中，將濾紙片(直徑6 mm)分別浸泡于藥液中4～5 h，吸取濃度約為5×105cfu/mL的菌懸液100 μL均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上，將供試藥液濾紙片和空白濾紙片(DMSO溶液浸泡)分別貼在瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的大小[16]。

2 結(jié)果

2.1 菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線 五種耐藥菌株的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示。

表1 耐藥菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.2 最低抑菌濃度 通過(guò)二倍微孔稀釋法對(duì)五種提取物進(jìn)行最低抑菌濃度測(cè)定，選取了臨床常見(jiàn)的兩種革蘭氏陽(yáng)性菌(SA、MRSA)和三種革蘭氏陰性菌(PA、Kleb、E.coli)作為試驗(yàn)菌株。如表2所示，在五種提取物中，EAE表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌活性，它能較為明顯抑制5種菌株的生長(zhǎng)，并且明顯抑制SA、MRSA、PA的生長(zhǎng)，最低抑菌濃度為10 mg/mL；EE對(duì)SA的抑菌活性也較強(qiáng)，MIC值為10 mg/mL；PE部位除對(duì)MRSA有較強(qiáng)抑菌活性外，對(duì)其它菌株敏感性均較低；5個(gè)不同極性部位對(duì)SA、MRSA、PA的抑制作用趨于一致，而對(duì)E.coli和Kleb的抑制作用均較弱。以上結(jié)果表明，對(duì)金黃色葡萄球菌起抑制效果的成分主要存在于EAE和EE部位，對(duì)MRSA和PA起抑制效果的成分主要存在于EAE部位，MIC值均為10 mg/mL。

表2 不同極性部位金釵石斛提取物最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定結(jié)果

2.3 抑菌活性 采用紙片擴(kuò)散法對(duì)5種提取物進(jìn)行抗菌活性測(cè)定[17]，結(jié)果如表3所示，5種提取物對(duì)MRSA的抑菌效果均較好，抑菌圈直徑分別為BE(12.25±1.65)mm、PE(17.25±1.25)mm、EAE(15.75±0.48)mm、EE(11±0.63)mm、WE(13±0.82)mm，說(shuō)明石油醚萃取部位的效果最好，正丁醇萃取部位和乙醇提取部位對(duì)PA、水部位對(duì)E.coli均無(wú)抑菌圈，說(shuō)明抑菌活性不明顯。

表3 不同極性部位金釵石斛提取物的抑菌活性

3 討論

中藥以其多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)及不良反應(yīng)少、無(wú)耐藥性、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越多的受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視[18]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為金釵石斛性微寒，味甘，歸胃、腎經(jīng)，用于食少干嘔，熱病傷津，病后虛熱，淺表性胃炎，滋陰降火，口干煩渴，慢性結(jié)腸炎等一系列病癥，目前對(duì)于金釵石斛的研究主要集中于其化學(xué)成分及其抗阿爾茲海默癥、抗腫瘤等藥理作用[19]，而對(duì)金釵石斛的抗菌活性研究報(bào)道較為少見(jiàn)。

在本研究中，首先采用水提法和醇提法得到水提物和乙醇提取物，并將一部分乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取得到不同極性部位的金釵石斛提取物，通過(guò)二倍微孔稀釋法和濾紙片擴(kuò)散法比較考察了不同極性部位金釵石斛提取物對(duì)5種常見(jiàn)耐藥菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，金釵石斛乙酸乙酯部位(EAE)表現(xiàn)出對(duì)5種菌株均有顯著抑菌活性，而水提取部位的抑菌效果均較差，尤其是對(duì)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌幾乎沒(méi)有抑制作用。

在觀察5種不同極性部位金釵石斛提取物抑菌效果時(shí)，用DMSO溶解后提取物本身存在一定顏色，或有渾濁現(xiàn)象，可能造成一定的誤差，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此采用二倍微孔稀釋法與瓊脂平板法相結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)其最低抑菌濃度[20]。

對(duì)比不同極性部位金釵石斛提取物的抑菌作用發(fā)現(xiàn)，EAE的抑菌作用最強(qiáng)，其次是BE和EE，PE除對(duì)MRSA具有一定的抑制作用外，對(duì)其他菌種抑制作用不明顯，而WE的抑菌作用最差。因此，5種提取物的抑制活性依次為EAE>EE>BE>PE>WE。與王亞萍等[21]報(bào)道的金釵石斛醇提物的抑菌效果顯著，而水提物幾乎沒(méi)有抑菌性或抑菌性較弱的結(jié)果基本一致。紙片擴(kuò)散法研究結(jié)果表明，5種提取物對(duì)MRSA均有較強(qiáng)的抑菌作用，PE的抑菌直徑為(17.25±1.25)mm，但對(duì)其余4種菌株的抑菌效果差；EAE對(duì)MRSA的抑菌圈直徑為(15.75±0.48)mm，且對(duì)其余4種菌株也有一定抑制作用，其抑菌圈直徑依次為MRSA> Kleb> E.coli> PA> SA。以上結(jié)果表明，金釵石斛中對(duì)SA具有抑制作用的成分主要存在于EAE和EE部位,對(duì)MRSA和PA起抑制作用的成分主要也在EAE部位，5種提取物對(duì)Kleb和E.coli 抑菌作用均較差。有文獻(xiàn)報(bào)道金釵石斛的多糖類(lèi)成分具有一定抑菌作用[15]，而多糖類(lèi)成分主要集中于水提取物，但是本研究結(jié)果顯示金釵石斛水提物抑菌活性最弱，而其乙酸乙酯部位抑菌作用最強(qiáng)，根據(jù)已有報(bào)道金釵石斛化學(xué)成分的極性判斷，金釵石斛中主要發(fā)揮抑菌作用的化學(xué)成分可能為能夠富集于乙酸乙酯部位的生物堿、菲類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)成分。

綜上所述，金釵石斛乙酸乙酯部位(EAE)具有較強(qiáng)的抑菌活性，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌活性?xún)?yōu)于革蘭氏陰性菌，可以為今后金釵石斛抑菌制劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

致謝：感謝遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周紅教授、黃雅思教授提供本文實(shí)驗(yàn)菌種，并給予實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。