蔡 鑫 陸宇清 孫 琴 江麗華

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，慢性高血糖可促進(jìn)DR的發(fā)展[1-3]。以往研究表明，高血糖能夠促進(jìn)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HREC)的增殖和遷移，加速血管生成，促進(jìn)DR的進(jìn)展[4]。因此，調(diào)節(jié)HREC功能為DR的治療提供了新的方向。

目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與DR的診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的miRNA，如miR-34a可通過(guò)靶向SIRT1促進(jìn)DR大鼠HREC凋亡[5]，miR-148a-3p可通過(guò)靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2減輕高糖誘導(dǎo)的DR[6]。研究人員利用miRNA芯片分析糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中miRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-338在DR組織中的表達(dá)顯著降低[7]。然而，miR-338在DR進(jìn)展中的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。以往研究發(fā)現(xiàn)，敲減circ_0001879能夠抑制高糖條件下HREC的增殖和遷移[8]。也有研究表明，高糖條件下HREC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)的表達(dá)顯著增加[9]。此外，Zhu等[10]研究證實(shí)，多效生長(zhǎng)因子(PTN)在增生型DR患者纖維血管膜中的表達(dá)顯著高于非糖尿病對(duì)照組，敲減PTN可有效減少缺氧缺糖導(dǎo)致的細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。本研究旨在探討STAT4介導(dǎo)的circ_0001879表達(dá)對(duì)高糖條件下HREC增殖和凋亡的影響及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器HREC購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清(FBS)、LipofectamineTM3000、PCR試劑盒和ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒載體由漢恒生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，RNase R購(gòu)自廣州吉賽生物科技股份有限公司，熒光原位雜交試劑盒購(gòu)自廣州伯信生物科技有限公司，miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR211)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，倒置顯微鏡(IX70)購(gòu)自北京普瑞賽司儀器有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，各種抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將HREC置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和1×105U·L-1鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染取HREC分為正常組(5.5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖組(25.0 mmol·L-1葡萄糖)和甘露醇對(duì)照組(5.5 mmol·L-1葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇)進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)。將高糖組細(xì)胞進(jìn)一步分組：Control組(HREC不做任何處理)、miR-NC組(HREC轉(zhuǎn)染miR-338陰性對(duì)照)、miR-mimic組(HREC轉(zhuǎn)染miR-338模擬物)、miR-inhibitor組(HREC轉(zhuǎn)染miR-338抑制劑)、miR-inhibitor+si-NC組(HREC轉(zhuǎn)染miR-338抑制劑+si-circ陰性對(duì)照)、miR-inhibitor+si-circ組(HREC轉(zhuǎn)染miR-338抑制劑+si-circ_0001879)、miR-mimic+pcDNA3.1-NC組(HREC轉(zhuǎn)染miR-338模擬物+PTN過(guò)表達(dá)載體陰性對(duì)照)、miR-mimic+pcDNA3.1-PTN組(HREC轉(zhuǎn)染miR-338模擬物+PTN過(guò)表達(dá)載體)、si-STAT4-NC組(HREC轉(zhuǎn)染si-STAT4陰性對(duì)照)、si-STAT4組(HREC轉(zhuǎn)染si-STAT4)、pcDNA3.1-STAT4-NC組(HREC轉(zhuǎn)染STAT4過(guò)表達(dá)載體陰性對(duì)照)、pcDNA3.1-STAT4組(HREC轉(zhuǎn)染STAT4過(guò)表達(dá)載體)，分組后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，使用LipofectamineTM3000試劑盒依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，連續(xù)轉(zhuǎn)染24 h。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞融合度達(dá)到80%的細(xì)胞用PBS沖洗及胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后將細(xì)胞以每孔4×105個(gè)接種于96孔板。分別在細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h和72 h時(shí)加入MTT溶液(5 g·L-1)，在培養(yǎng)箱中孵育4 h形成藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，加入二甲基亞砜。用平板閱讀器測(cè)量各組樣品490 nm處光密度(D490)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞接種在96孔板上(每孔1×105個(gè)細(xì)胞)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在黑暗中用10 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶在4 ℃下反應(yīng)30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)因子mRNA表達(dá)用Trizol試劑提取總RNA，用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。之后，采用PCR試劑盒和ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件為：95 ℃初始變性10 min，95 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃10 s，以GAPDH作為內(nèi)參測(cè)定circ_0001879、PTN、STAT4的表達(dá)，以U6為內(nèi)參測(cè)定miR-338的表達(dá)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行定量，引物序列見(jiàn)表1。

1.7 原位熒光雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ_0001879的細(xì)胞定位將HREC用40 g·L-1的多聚甲醛固定，體積分?jǐn)?shù)0.5%的Triton X-100預(yù)雜交處理后，將RNA探針加入雜交緩沖液中繼續(xù)培養(yǎng)。用FITC標(biāo)記的circ_0001879探針與細(xì)胞進(jìn)行雜交反應(yīng)，DAPI染色細(xì)胞核，使用共聚焦顯微鏡拍照。

表1 各基因引物序列

1.8 RNase R酶切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ_0001879的環(huán)狀結(jié)構(gòu)依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將RNA(5 mg)與RNase R(3×103U·g-1)在37 ℃下孵育20 min。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況，Mock組作為對(duì)照。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ_0001879與miR-338以及miR-338與PTN的靶向關(guān)系將HREC以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，使用LipofectamineTM3000將pMIR熒光素酶報(bào)告體(circ-WT/MUT或PTN-WT/MUT)和miR-338模擬物/miR-NC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照使用說(shuō)明書(shū)，用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10 ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)STAT4和circ_0001879的結(jié)合關(guān)系用40 g·L-1多聚甲醛處理細(xì)胞，甘氨酸終止反應(yīng)后用PBS沖洗細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解緩沖液充分反應(yīng)，微球菌核酸酶消化染色質(zhì)獲得片段。在染色質(zhì)片段中加入蛋白A+G瓊脂糖/鮭魚(yú)精子DNA，4 ℃下反應(yīng)30 min。使用STAT4與IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，加入蛋白A+G瓊脂糖/鮭魚(yú)精子DNA，在60 ℃下振蕩混勻反應(yīng)4 min，純化DNA并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)分析兩組間計(jì)量資料的差異，采用單因素方差分析比較多組間計(jì)量資料的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組HREC circ_0001879、miR-338和PTN表達(dá)比較與甘露醇對(duì)照組HREC中 circ_0001879(1.21±0.13)、miR-338(0.99±0.08)和PTN(1.12±0.11)的表達(dá)相比，高糖組HREC中circ_0001879(2.93±0.21)和PTN(3.62±0.33)的表達(dá)顯著升高，而miR-338(0.44±0.05)的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。正常組HREC中 circ_0001879(1.00±0.13)、miR-338(1.00±0.09)和PTN(1.00±0.11)的表達(dá)與甘露醇對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。表明高糖處理能夠誘導(dǎo)HREC中circ_0001879和PTN的表達(dá)，抑制miR-338的表達(dá)。

2.2 miR-338對(duì)高糖條件下HREC增殖的影響為了探究miR-338對(duì)高糖處理的HREC增殖的影響，通過(guò)MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力和凋亡率，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-mimic組HREC在高糖處理48 h和72 h后的增殖活力被抑制，miR-inhibitor組HREC在高糖處理48 h和72 h后的增殖活力顯著增高(均為P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-mimic組HREC凋亡率顯著升高，而miR-inhibitor組HREC凋亡率則降低(均為P<0.05)。Control組和miR-NC組各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表2)。以上結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)miR-338能夠抑制高糖處理的HREC的增殖活力，促進(jìn)HREC凋亡，而敲減miR-338的表達(dá)則作用相反。

表2 高糖處理不同時(shí)間各組HREC增殖活力和凋亡率比較

2.3 circ_0001879與miR-338的關(guān)系及其對(duì)高糖條件下HREC的作用

2.3.1 circ_0001879和miR-338的靶向關(guān)系Circular數(shù)據(jù)庫(kù)顯示circ_0001879和miR-338之間存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。原位熒光雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：circ_0001879主要定位于HREC的細(xì)胞質(zhì)。RNase R 酶切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：相對(duì)于Mock組，線(xiàn)性RNA在RNase組中表達(dá)顯著降低(P<0.05)，circ_0001879在Mock組和RNase組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1A)，這提示，circ_0001879具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)且不易被降解。與miR-NC+circ-WT共轉(zhuǎn)染組相比，miR-mimic+circ-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(圖1B)。以上結(jié)果提示，circ_0001879和miR-338之間存在靶向關(guān)系。

圖1 circ_0001879特異性結(jié)合miR-338的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A：RNase R 酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與Mock組相比，*P<0.05；B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與miR-NC+circ-WT共轉(zhuǎn)染組相比，#P<0.05。

2.3.2 si-circ抑制miR-inhibitor對(duì)高糖條件下HREC增殖的影響為了檢測(cè)circ_0001879和miR-338對(duì)高糖處理的HREC的聯(lián)合作用，通過(guò)MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力和凋亡率，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-inhibitor組HREC在高糖處理24 h、48 h和72 h后的增殖活力均升高，凋亡率均降低(均為P<0.05)。與miR-inhibitor+si-NC組相比，miR-inhibitor+si-circ組HREC在高糖處理24 h、48 h和72 h后的增殖活力均降低，凋亡率均升高(均為P<0.05)(表3)。以上結(jié)果提示，miR-inhibitor對(duì)高糖處理的HREC的作用能夠被si-circ部分抑制。

表3 高糖處理不同時(shí)間各組HREC增殖活力和凋亡率比較

2.4 PTN和miR-338的關(guān)系及其對(duì)高糖條件下HREC的作用

2.4.1 miR-338與PTN的靶向關(guān)系在miRWalk與Targetscan網(wǎng)站獲取miR-338的靶基因并且取交集，共得到5個(gè)交集基因：CHTOP、PVALB、C16ORF87、PTN、FKBP1A。查閱相關(guān)文獻(xiàn)后選擇PTN作為研究對(duì)象。PTN和miR-338-3p的特異性結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖2A。采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢驗(yàn)二者之間的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC+PTN-WT共轉(zhuǎn)染組相比，miR-mimic+PTN-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性被顯著抑制(P<0.05)(圖2B)。進(jìn)一步驗(yàn)證miR-338和circ_0001879對(duì)PTN表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，相對(duì)于miR-NC組，miR-inhibitor組中PTN表達(dá)增強(qiáng)，而與miR-inhibitor+si-NC組相比，PTN在miR-inhibitor+si-circ組的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖2C)。以上結(jié)果提示，PTN是miR-338的一個(gè)靶基因，且其表達(dá)受miR-338和circ_0001879的影響。

2.4.2 PTN、miR-338對(duì)高糖條件下HREC增殖的影響為了檢測(cè)PTN和miR-338對(duì)高糖處理的HREC的聯(lián)合作用，通過(guò)MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力和凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-mimic組HREC在高糖處理24 h、48 h和72 h后增殖活力均顯著降低，凋亡率均升高；而與miR-mimic+pcDNA3.1-NC組相比，miR-mimic+pcDNA3.1-PTN組HREC在高糖處理24 h、48 h和72 h后增殖活力均顯著升高，而凋亡率均降低(均為P<0.05)(表4)。以上結(jié)果提示，PTN過(guò)表達(dá)能夠部分抑制miR-338過(guò)表達(dá)對(duì)高糖處理的HREC的作用。

圖2 PTN和miR-338的靶向關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果 A：miR-338和PTN的特異性結(jié)合位點(diǎn)。B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與miR-NC+PTN-WT共轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05。C：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PTN在各組細(xì)胞中的表達(dá)，與miR-NC組相比，#P<0.05；與miR-inhibitor+si-NC組相比，^P<0.05。

表4 高糖處理不同時(shí)間各組HREC增殖活力和凋亡率比較

2.5 STAT4對(duì)高糖處理的HREC中circ_000187表達(dá)的影響在JASPAR網(wǎng)站(http://jaspar.genereg.net)檢索發(fā)現(xiàn)，STAT4與circ_0001879的啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-STAT4-NC組相比，si-STAT4組HREC circ_0001879的表達(dá)顯著降低，而與pcDNA3.1-STAT4-NC組相比，pcDNA3.1-STAT4組HREC circ_0001879的表達(dá)顯著增強(qiáng)(均為P<0.05)(圖3B)。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STAT4與circ_0001879啟動(dòng)子區(qū)域的B1、B3結(jié)合(圖3C)。以上結(jié)果提示，STAT4能夠與circ_0001879的啟動(dòng)子結(jié)合并且促進(jìn)circ_0001879的轉(zhuǎn)錄。

圖3 STAT4對(duì)高糖處理的HREC中circ_000187表達(dá)的影響 A：JASPAR網(wǎng)站預(yù)測(cè)的STAT4與circ_0001879的前三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。B：過(guò)表達(dá)和敲減STAT4對(duì)HREC中circ_0001879表達(dá)的影響，與si-STAT4-NC組相比，*P<0.05；與pcDNA3.1-STAT4-NC組相比，#P<0.05。C：ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與anti-IgG組相比，^P<0.05。

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs在DR的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其能夠調(diào)節(jié)HREC的增殖、凋亡并可促進(jìn)血管生成[11-14]。有報(bào)道指出，miR-338在DR患者血清中的表達(dá)顯著降低，并能通過(guò)調(diào)控靶基因進(jìn)而影響血管生成[15]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同血糖濃度下HREC中相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與甘露醇對(duì)照組相比，miR-338在高糖處理的HREC中的表達(dá)顯著下調(diào)，這與前人的研究結(jié)果相一致[15]。功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-338可抑制高糖條件下HREC的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制miR-338則效果相反。因此，我們推測(cè)miR-338能夠通過(guò)調(diào)控HREC的增殖和凋亡進(jìn)而參與DR的進(jìn)展。

之后，本研究進(jìn)一步探究了miR-338在DR進(jìn)展中的作用機(jī)制，借助靶向關(guān)系預(yù)測(cè)網(wǎng)站與雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-338和circ_0001879之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。以往有研究表明，敲減circ_0001879能夠抑制高糖條件下HREC的增殖和遷移[8]。本研究也進(jìn)一步證實(shí)了circ_0001879在高糖條件下HREC中表達(dá)升高，miR-338 inhibitor能夠促進(jìn)高糖條件下HREC的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而敲減circ_0001879能夠部分逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果。以上結(jié)果表明，miR-338受circ_0001879的負(fù)調(diào)控，對(duì)DR的發(fā)展可產(chǎn)生一定作用。

PTN是一種多效性生長(zhǎng)因子，已被證實(shí)在多種腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮促癌作用[16-17]。此外，PTN也被證實(shí)能夠誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成[18]。PTN在DR進(jìn)展中的作用已得到初步明確，敲減PTN能夠抑制DR中HREC的增殖、遷移和血管生成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTN在高糖條件下的HREC中表達(dá)升高，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTN是miR-338的下游靶基因，并證實(shí)了circ_0001879能夠通過(guò)miR-338進(jìn)而調(diào)控PTN的表達(dá)。功能性實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-338能夠抑制DR中HREC的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而在過(guò)表達(dá)PTN后，這一結(jié)果得到部分逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，circ_0001879/miR-338/PTN軸可調(diào)控HREC的增殖與凋亡并參與DR進(jìn)展。以往也有研究證實(shí)，在高糖條件下的HREC中STAT4表達(dá)升高[9]。而本研究則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，STAT4能夠作為轉(zhuǎn)錄因子激活circ_0001879的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)在高糖條件下HREC中circ_0001879的表達(dá)，因此我們推測(cè)，circ_0001879在DR進(jìn)展中的作用受STAT4的調(diào)控。

本研究也存在一些不足之處，如未進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，僅建立了體外DR模型，未進(jìn)一步驗(yàn)證STAT4對(duì)高糖處理的HREC的增殖與凋亡的影響等。我們會(huì)在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。

綜上所述，本研究數(shù)據(jù)表明，STAT4能夠激活circ_0001879的轉(zhuǎn)錄，circ_0001879進(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)miR-338/PTN軸促進(jìn)DR中HREC增殖，抑制細(xì)胞凋亡。干擾STAT4/circ_0001879/miR-338/PTN軸可為DR的治療提供一種新的思路。