崔鈺瑩 邱 宇 高洪蓮 張 磊

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)是早產(chǎn)兒和低出生體重兒發(fā)生的一種視網(wǎng)膜血管增殖性病變，被視為引起兒童視覺(jué)受損的重要疾病之一，嚴(yán)重病例可導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離及視力永久喪失[1-2]。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜發(fā)育不全，存在大量無(wú)血管區(qū)，加之高濃度氧氣的吸入使視網(wǎng)膜血管缺氧痙攣閉塞，成為視網(wǎng)膜新生血管生成的主要原因，氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管病變(OIR)模型是模擬ROP最常用模型。缺氧刺激血管生長(zhǎng)調(diào)控因子分泌，特別是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)育，所以玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物及激光是治療ROP最主要的方式[3-5]。臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)抗VEGF藥物治療后的ROP患兒視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的發(fā)育趨近于正常水平，但是卻仍然存在視網(wǎng)膜功能異常，后期近視、弱視、斜視的發(fā)生率高于同齡期幼兒[6]。

最近研究表明，VEGF除了調(diào)節(jié)血管生成作用外，還具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，在神經(jīng)元的發(fā)育、修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮廣泛的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)作用，可促進(jìn)視網(wǎng)膜上無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞產(chǎn)生多巴胺(DA)[7]。DA是調(diào)控眼軸增長(zhǎng)和視網(wǎng)膜信號(hào)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其通過(guò)改變視網(wǎng)膜電路，在光照環(huán)境下驅(qū)動(dòng)視錐細(xì)胞，在暗環(huán)境中驅(qū)動(dòng)視桿細(xì)胞，且對(duì)近視的發(fā)展具有保護(hù)作用[8]。本研究主要通過(guò)高流量吸氧建立OIR模型，探討康柏西普(Conbercept)玻璃體內(nèi)注射對(duì)OIR模型小鼠視網(wǎng)膜DA含量的影響，并分析其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)7 d齡C57BL/6小鼠100只(由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供)，雌雄不限，同母鼠共同養(yǎng)育。自然照明環(huán)境下12 h/12 h晝夜循環(huán)，自由攝水?dāng)z食，維持溫度為22～25 ℃，濕度為50%～70%。本實(shí)驗(yàn)遵守濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理委員會(huì)制定的動(dòng)物福利倫理要求，給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器Anti-Tyrosine Bydroxylase抗體(美國(guó) Abcam公司ab6211)；VEGF抗體C-1鼠單抗(美國(guó)Santa公司 sc-72689)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(ZB-2305)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301)購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；PVDF膜、超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海雅梅生物醫(yī)藥科技有限公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FITC-Dextran，相對(duì)分子質(zhì)量 2×106)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理將100只7 d齡小鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組、OIR組、OIR+生理鹽水(NS)組及OIR+ Conbercept組，每組25只?？瞻讓?duì)照組小鼠于常氧環(huán)境中飼養(yǎng)至17 d齡，不做處理。將OIR組、OIR+NS組和OIR+ Conbercept組所有7 d齡C57BL/6小鼠及其喂養(yǎng)母鼠放置于接通體積分?jǐn)?shù)100%濕潤(rùn)醫(yī)用氧氣的密閉容器內(nèi)，氧流量為0.50～0.75 L·min-1，每日6次使用氧氣濃度分析儀檢測(cè)氧箱內(nèi)氧濃度，使之維持在體積分?jǐn)?shù)(75±5)%，并在此環(huán)境中飼養(yǎng)小鼠至12 d齡，OIR+NS組和OIR+ Conbercept組小鼠分別行右眼玻璃體內(nèi)注射1 μL NS、1 μL Conbercept后，置于常氧環(huán)境中飼養(yǎng)至17 d齡。玻璃體內(nèi)注射后均用氧氟沙星眼膏涂于術(shù)眼，預(yù)防感染。

1.2.2 HE染色每組隨機(jī)選取5只17 d齡小鼠，使用頸椎脫臼法處死，快速取出右眼，于40 g·L-1多聚甲醛中固定2 h，后置于100 g·L-1、200 g·L-1、300 g·L-1蔗糖溶液中脫水。取OCT包埋劑包埋眼球并置于冰凍切片機(jī)內(nèi)冷凍包埋。平行于角膜至視神經(jīng)的矢狀位方向行連續(xù)切片，厚度為6 μm。常規(guī)脫水后行HE染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)。每組標(biāo)本隨機(jī)選取20張照片(剔除包含視盤(pán)平面者)，計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。

1.2.3 視網(wǎng)膜鋪片每組隨機(jī)選取5只17 d齡小鼠右眼FITC-Dextran熒光造影后行視網(wǎng)膜鋪片，熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)變化。將 FITC-Dextran溶于40 g·L-1多聚甲醛中，濃度為50 g·L-1，搖勻。20 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后固定，沿小鼠肋弓打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)胸骨，分離心臟，于肝上方尋找并阻斷腹主動(dòng)脈。用剪刀剪開(kāi)右心耳，抽取造影液1 mL，注入小鼠心尖處。以口、鼻、耳廓呈淡黃色為灌注成功。迅速摘出小鼠眼球，置于40 g·L-1多聚甲醛固定30 min。在顯微鏡下沿角鞏膜緣剪開(kāi)眼球，去除角膜、晶狀體及外層鞏膜、葡萄膜，置于干凈載玻片上鋪平，放射狀剪開(kāi)視網(wǎng)膜，用細(xì)毛筆輕輕刷去殘留的葡萄膜組織，甘油固定封片。取490 nm激發(fā)光520 nm濾過(guò)波，于熒光顯微鏡下觀察并拍片。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)每組隨機(jī)選取10只17 d齡小鼠行Western blot檢測(cè)右眼視網(wǎng)膜中VEGF、酪氨酸羥化酶(TH)蛋白相對(duì)表達(dá)量。將小鼠頸椎脫臼處死后迅速取出右眼，冰上解剖眼球，剝離出視網(wǎng)膜迅速冷凍于-80 ℃儲(chǔ)存。將視網(wǎng)膜組織加入裂解液及蛋白酶抑制劑(1100)后組織勻漿儀裂解，冰上靜置30 min后轉(zhuǎn)移至EP 管中，4 ℃ 15 000 r·min-1離心15 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)定各組蛋白濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸10 min。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(VEGF稀釋度為11000；TH稀釋度為1500；GAPDH稀釋度為 15000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，TBST沖洗，化學(xué)發(fā)光法顯影，Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.2.5 高效液相色譜儀檢測(cè)取各組17 d齡小鼠5只，頸椎脫臼法處死，摘出右眼眼球后，使用顯微鏡于冰上剝離出視網(wǎng)膜，放入液氮中冷凍。視網(wǎng)膜樣品分別稱(chēng)重并記錄，組織勻漿后，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣，高效液相色譜儀及電化學(xué)測(cè)量器測(cè)量視網(wǎng)膜DA含量。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察結(jié)果空白對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜切片HE染色結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜各層排列整齊有序，未見(jiàn)或偶見(jiàn)切片中血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜；OIR組小鼠視網(wǎng)膜切片中內(nèi)界膜處細(xì)胞排列紊亂，視網(wǎng)膜各層紊亂，可見(jiàn)較多量突破內(nèi)界膜的新生血管管腔；OIR+NS組小鼠視網(wǎng)膜切片可見(jiàn)較多量突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核；OIR+ Conbercept組小鼠視網(wǎng)膜切片可見(jiàn)視網(wǎng)膜各層稍紊亂，有少量血管內(nèi)皮細(xì)胞核突破內(nèi)界膜，部分切片未見(jiàn)視網(wǎng)膜血管(圖1)?？瞻讓?duì)照組小鼠視網(wǎng)膜切片中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)為(0.85±0.93)個(gè)，OIR組、OIR+NS組小鼠視網(wǎng)膜切片中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)分別為(20.90±2.89)個(gè)、(20.70±3.24)個(gè)，均較空白對(duì)照組明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；與OIR組及OIR+NS組相比，OIR+ Conbercept組小鼠視網(wǎng)膜切片中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)明顯減少，為(10.70±2.56)個(gè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；OIR組與OIR+NS組小鼠視網(wǎng)膜切片中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果熒光顯微鏡下可見(jiàn)，空白對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜血管呈放射狀分布，可達(dá)視網(wǎng)膜邊緣，血管分布均勻，無(wú)或者較少有無(wú)血管區(qū)，血管基本發(fā)育完全；從視盤(pán)中央發(fā)出的淺層和深層毛細(xì)血管到達(dá)鋸齒緣。OIR組小鼠可見(jiàn)視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張、迂曲，形成團(tuán)簇狀新生血管，視盤(pán)周?chē)霈F(xiàn)大片狀無(wú)灌注區(qū)，血管分布紊亂且不均勻；視網(wǎng)膜中周部及靠近無(wú)灌注區(qū)附近的血管密度明顯增高，血管分布紊亂。OIR+NS組小鼠視網(wǎng)膜中周部出現(xiàn)片狀無(wú)灌注區(qū)，可見(jiàn)明顯熒光滲漏。OIR+ Conbercept組小鼠視盤(pán)周?chē)梢?jiàn)小片狀無(wú)灌注區(qū)，血管分布較均勻，排列較規(guī)則，新生血管簇?cái)?shù)量少于OIR組(圖2)。

圖1 各組17 d齡小鼠視網(wǎng)膜切片HE染色(×400) A：空白對(duì)照組;B：OIR組;C：OIR+NS組;D：OIR+ Conbercept組。紅色箭頭示視網(wǎng)膜層間結(jié)構(gòu)紊亂，黑色箭頭示突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核及新生血管。

2.3 Western blot 檢測(cè)結(jié)果Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，OIR組、OIR+NS組及OIR+Conbercept組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均增加(均為P<0.05)；OIR+ Conbercept組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均較OIR組及OIR+NS組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；OIR組與OIR+NS組小鼠相比，視網(wǎng)膜中VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OIR組、OIR+NS組及OIR+ Conbercept組小鼠視網(wǎng)膜中TH蛋白的相對(duì)表達(dá)量均較空白對(duì)照組減小(均為P<0.05)；OIR+ Conbercept組小鼠視網(wǎng)膜中TH蛋白相對(duì)表達(dá)量均較OIR組及OIR+NS組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；OIR組與OIR+NS組相比，視網(wǎng)膜中TH蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3、表2)。

圖3 Western blot檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜中TH、VEGF蛋白表達(dá)電泳圖 1：OIR組；2：OIR+NS組；3：空白對(duì)照組；4：OIR+ Conbercept組。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF及TH蛋白的相對(duì)表達(dá)量

2.4 高效液相色譜儀檢測(cè)結(jié)果空白對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜DA含量為(0.051±0.022)μg·g-1， OIR組、 OIR+NS組小鼠視網(wǎng)膜DA含量分別為(0.027±0.008)μg·g-1、(0.026±0.010)μg·g-1，均較空白對(duì)照組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；OIR+ Conbercept組小鼠視網(wǎng)膜DA含量為(0.016±0.006)μg·g-1，與OIR組及OIR+NS組小鼠視網(wǎng)膜DA含量相比明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；OIR組與OIR+NS組小鼠視網(wǎng)膜DA含量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

ROP是一種嚴(yán)重致殘性疾病，其特征在于視網(wǎng)膜血管生成異常，纖維組織增生后發(fā)展為滲出性牽拉性視網(wǎng)膜脫離。隨著早產(chǎn)兒監(jiān)護(hù)、吸氧及治療的發(fā)展，新生兒成活率增加，加之早期眼底篩查技術(shù)的完善，ROP的發(fā)病率也逐年增加。為模擬ROP，本實(shí)驗(yàn)選取高流量吸氧建立OIR模型。因玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物會(huì)進(jìn)入全身循環(huán)，可能影響對(duì)側(cè)眼視網(wǎng)膜VEGF含量，所以本實(shí)驗(yàn)選取右眼為實(shí)驗(yàn)眼[9-10]。本研究結(jié)果可見(jiàn)，OIR組小鼠視盤(pán)周?chē)梢?jiàn)大片無(wú)灌注區(qū)，且視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張、迂曲，大量新生血管形成及熒光素滲漏；玻璃體內(nèi)注射Conbercept后可見(jiàn)新生血管減少，視網(wǎng)膜無(wú)血管灌注區(qū)減少。有研究表明，氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的神經(jīng)視網(wǎng)膜障礙可能與OIR誘導(dǎo)DA釋放有關(guān)，而DA是調(diào)節(jié)神經(jīng)視網(wǎng)膜信號(hào)和眼軸生長(zhǎng)的神經(jīng)遞質(zhì)，且有大量研究證實(shí)了DA在近視的發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[11]。

DA是兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。DA是由多巴胺能神經(jīng)元攝取酪氨酸，由限速酶TH轉(zhuǎn)化為左旋多巴，后經(jīng)多巴胺脫羧酶轉(zhuǎn)化為DA。而DA的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物為3，4-二羥基苯乙酸(多巴克，DOPAC)[8,12]。 視網(wǎng)膜中DA的唯一來(lái)源是無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的一個(gè)特殊亞類(lèi)，即多巴胺能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(DAC)。在小鼠視網(wǎng)膜上大約有500個(gè)DAC稀疏且規(guī)則地分布。它們的樹(shù)突和軸突廣泛重疊，在內(nèi)叢狀層中形成密集的網(wǎng)絡(luò)。一些軸突樣突起也穿過(guò)內(nèi)核層，在外叢狀層形成成簇的精細(xì)突起。Spix等[13]在OIR模型中發(fā)現(xiàn)，盡管中央視網(wǎng)膜毛細(xì)血管明顯脫落，但在12 d齡小鼠OIR模型視網(wǎng)膜中DAC的總數(shù)沒(méi)有變化；然而，在17 d齡小鼠OIR模型視網(wǎng)膜中觀察到DAC的顯著丟失，其中，中央無(wú)血管區(qū)域的細(xì)胞丟失比周?chē)律軈^(qū)域更嚴(yán)重，DAC大量丟失，導(dǎo)致TH免疫反應(yīng)性降低和視網(wǎng)膜DA水平降低。除DAC外，之前的一項(xiàng)研究報(bào)道了OIR大鼠模型中將桿狀信號(hào)從桿狀通路傳遞到錐體通路的關(guān)鍵中間神經(jīng)元AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的死亡[14]。此外，與DAC和AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞相比，其他無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均不易受到OIR的影響[15-17]。本研究結(jié)果顯示，OIR組小鼠視網(wǎng)膜中TH蛋白相對(duì)表達(dá)量下降，與上述文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

Conbercept為一種國(guó)產(chǎn)新型重組可溶性VEGF受體蛋白，具有多靶點(diǎn)、親和力強(qiáng)、作用時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，是治療ROP的常用藥物[18]。Conbercept是VEGFR1的2號(hào)決定簇和VEGFR2的3號(hào)、4號(hào)決定簇與人免疫球蛋白G的Fc段結(jié)合形成的人源化重組融合蛋白，大多數(shù)的研究都利用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Conbercept對(duì)新生血管的形成有抑制作用，并且抑制作用優(yōu)于其他類(lèi)型的抗VEGF藥物[19]。VEGF是具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂活性的二聚體糖蛋白。但近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，VEGF在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)保護(hù)和成年神經(jīng)元修復(fù)、生存、再生過(guò)程中均發(fā)揮著非常廣泛和復(fù)雜的作用[20-21]。VEGF在體內(nèi)外培養(yǎng)對(duì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，并能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和存活，且認(rèn)為它的神經(jīng)保護(hù)作用是一種不依賴(lài)于其促進(jìn)血管生成功能的直接作用。有研究表明，VEGF可以減輕多巴胺能神經(jīng)元的變性損傷，促使紋狀體幸存的神經(jīng)末梢釋放的DA增多，從而抑制單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂，改善動(dòng)物神經(jīng)功能[22]。Saint-Geniez等[23]曾對(duì)表達(dá)sFlt1(sFlt1是由mRNA剪接產(chǎn)生的VEGFR1的可溶性形式，是一種有效的VEGF抑制劑)的14 d齡小鼠行視網(wǎng)膜切片觀察，結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜內(nèi)核層和外核層均有顯著細(xì)胞凋亡；第28天，細(xì)胞死亡增加導(dǎo)致內(nèi)核層和外核層的厚度顯著降低；內(nèi)核層主要由Müller細(xì)胞、雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞構(gòu)成，外核層包含光感受器胞體，電鏡下可見(jiàn)多種細(xì)胞凋亡的典型征象。

本研究結(jié)果證明，Conbercept對(duì)ROP新生血管有較好的抑制作用，這與較多文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[19,24-25]。本研究結(jié)果顯示，在OIR模型中，視網(wǎng)膜VEGF含量明顯增加，Conbercept玻璃體內(nèi)注射5 d后，小鼠視網(wǎng)膜VEGF及TH蛋白的相對(duì)表達(dá)量均較OIR組及OIR+NS組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，說(shuō)明Conbercept抑制視網(wǎng)膜新生血管產(chǎn)生的同時(shí)，進(jìn)一步影響TH的表達(dá)量。本研究高效液相色譜儀檢測(cè)結(jié)果顯示，OIR+ Conbercept組小鼠視網(wǎng)膜DA含量與空白對(duì)照組、OIR組及OIR+NS組相比，均顯著減少(均為P<0.05)，但其作用機(jī)制及作用位點(diǎn)尚未明確，可能與DAC的凋亡或其下游蛋白的表達(dá)有關(guān)[26]。OIR模型小鼠玻璃體內(nèi)注射Conbercept后視網(wǎng)膜中TH表達(dá)及DA含量進(jìn)一步下降的原因可能為，Conbercept抑制VEGF的生物學(xué)作用，使得VEGF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用、促進(jìn)突觸增長(zhǎng)的作用減弱，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究中，雖然空白對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF相對(duì)表達(dá)量低，但TH蛋白相對(duì)表達(dá)量及DA含量均較OIR組、OIR+NS組和OIR+ Conbercept組高，我們認(rèn)為是由于OIR模型受高氧及新生血管破壞視網(wǎng)膜神經(jīng)分泌功能所致，即使VEGF含量高，也不能使DA分泌量增加。而在正常視網(wǎng)膜中，可能正常生理劑量的VEGF即可保證DA正常分泌。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中曾行玻璃體內(nèi)注射2 μL Conbercept，探索小鼠視網(wǎng)膜DA含量是否與Conbercept含量有關(guān)，但小鼠玻璃體容積有限，2 μL Conbercept玻璃體內(nèi)注射時(shí)，顯微鏡下可以看到有部分Conbercept自注射處流出，5 d后部分小鼠的視網(wǎng)膜切片可見(jiàn)眼球肌化，視網(wǎng)膜厚度變薄甚至無(wú)視網(wǎng)膜組織，所以Conbercept注射量是否與DA含量減少呈劑量關(guān)系還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，玻璃體內(nèi)注射Conbercept可抑制視網(wǎng)膜新生血管生成，使視網(wǎng)膜中VEGF含量降低，在治療新生血管的同時(shí)，亦可使視網(wǎng)膜中TH、DA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步下降，但其作用機(jī)制尚不明確，且是否有劑量相關(guān)性還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究?；赩EGF可營(yíng)養(yǎng)DAC，促進(jìn)突觸分泌，DA對(duì)視網(wǎng)膜的神經(jīng)發(fā)育及對(duì)近視的抑制有重要作用，所以在臨床中怎樣避免抗VEGF的副作用，或如何通過(guò)調(diào)整DA含量來(lái)保護(hù)抗VEGF治療后ROP患兒的視網(wǎng)膜功能是非常重要的研究方向，這也是我們下一步研究的重點(diǎn)，本研究為此類(lèi)臨床問(wèn)題的解決提供了新的思路。