胡昕瀅 曹 麗 繆 晟 高 燁

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病微血管并發(fā)癥中最常見病變之一,是人類致盲的主要原因[1-2]。DR特征性病理變化是視網(wǎng)膜缺血缺氧導(dǎo)致眼內(nèi)新生血管形成。有證據(jù)表明，新生血管的形成是由于血管生成刺激因子與抑制因子的失衡引起的[3]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是新生血管形成和引起血管滲漏的強(qiáng)效誘導(dǎo)因子，可由多種細(xì)胞分泌，是刺激新生血管生長的最重要因素[4-5]，已成為現(xiàn)今大多數(shù)抗VEGF治療的靶標(biāo)。然而，反復(fù)玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物仍無法避免后期新生血管復(fù)發(fā)[6]。

αA-晶狀體蛋白和αB-晶狀體蛋白是哺乳動物晶狀體中的主要蛋白質(zhì)成分，αB-晶狀體蛋白是小分子熱休克蛋白，能保護(hù)其他蛋白免受應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷[7]。αB-晶狀體蛋白與新生血管性眼病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。體外研究提示[8]，理論上可以利用αB-晶狀體蛋白的分子伴侶功能來調(diào)節(jié)病理性新生血管形成和局部缺血組織中VEGF的分泌，從而改善DR[9]。然而目前尚無研究從臨床角度驗證αB-晶狀體蛋白與DR的關(guān)系。人晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)能夠表達(dá)αB-晶狀體蛋白[10]。本研究目的旨在探究不同階段DR患者LEC中αB-晶狀體蛋白的表達(dá)及其與DR的關(guān)系，試圖從臨床角度補(bǔ)充說明αB-晶狀體蛋白與DR等新生血管性眼病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院眼科2018年5月至2019年4月收治的年齡相關(guān)性白內(nèi)障和糖尿病并發(fā)性白內(nèi)障患者98例(98眼)，均進(jìn)行超聲乳化白內(nèi)障吸除聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)(由同一術(shù)者進(jìn)行)，術(shù)中搜集晶狀體前囊膜。根據(jù)Emery核硬度分級標(biāo)準(zhǔn)[11]，入選的患者晶狀體核硬度均為III度。納入標(biāo)本需排除先天性、繼發(fā)性白內(nèi)障以及合并青光眼、葡萄膜炎、眼外傷、內(nèi)眼手術(shù)史或其他非糖尿病眼底病變的患者，此外，存在晶狀體前囊膜混濁或特殊晶狀體混濁形態(tài)的白內(nèi)障患者亦排除在外。以空腹血糖≥7.0 mmol·L-1和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol·L-1為診斷糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)[12]，將入院接受白內(nèi)障手術(shù)患者分為非糖尿病(NDM)組25例(25眼)、糖尿病組73例(73眼)。糖尿病組患者通過眼底鏡、熒光素眼底血管造影檢查[13]，再分為非糖尿病視網(wǎng)膜病變(NDR)組24例、非增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(NPDR)組24例和增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)組25例。本研究經(jīng)東南大學(xué)中大醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批件號：2018ZDSYLL047-P01)，所有患者在招募前均知情同意且臨床資料完整。

1.2 方法術(shù)前患眼常規(guī)局部麻醉并消毒鋪巾，術(shù)中連續(xù)環(huán)形撕囊獲取直徑5.0～5.5 mm的中央?yún)^(qū)晶狀體前囊膜樣本。顯微組織剪剪取一個象限晶狀體前囊膜樣本，立即浸泡于40 g·L-1多聚甲醛中固定，用于免疫熒光染色檢測；余樣本即刻置消毒干燥EP管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于Western blot檢測。

1.2.1 免疫熒光染色檢測由于晶狀體前囊膜樣本中，中央?yún)^(qū)LEC多呈規(guī)則的單層立方上皮且貼附于晶狀體前囊內(nèi)表面，故對本研究所取樣本進(jìn)行鋪片染色。將固定好的晶狀體前囊膜樣本取出后用PBS洗滌，采用Triton X-l00溶液室溫打孔10 min。將打孔完畢的樣本再次洗滌后封閉非特異性抗原2 h。配制抗αB-晶狀體蛋白鼠抗人單克隆抗體(一抗，11000，美國Abcam公司)，將封閉后的樣本洗滌后放入一抗溶液中，然后將其置入濕房，4 ℃孵育過夜，PBS溶液代替一抗作為自發(fā)熒光對照。配制混合FITC標(biāo)記的山羊抗鼠抗體(二抗，1500，美國Jackson公司)與細(xì)胞核染色劑DAPI (11000，美國Abcam公司)的溶液，將樣本從一抗溶液中取出，洗滌后放入含熒光標(biāo)記的二抗和DAPI溶液中，置避光暗盒中，室溫放置2 h。最后將樣本從二抗和DAPI的混合溶液中取出，洗滌完畢后平鋪貼附于多聚賴氨酸防脫載玻片上，滴加適量熒光封片劑于晶狀體前囊膜組織上，蓋上蓋玻片，即刻用共聚焦顯微鏡觀察鋪片結(jié)果，檢測患者LEC中αB-晶狀體蛋白陽性表達(dá)量。

1.2.2 Western blot檢測實驗開始前將樣本置于4 ℃冰箱解凍，隨后加入適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，并通過渦旋實現(xiàn)細(xì)胞裂解來制備總蛋白提取物。采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。每個樣本取40 μg蛋白并標(biāo)記組別，100 ℃沸水煮5 min，冷卻至室溫后分別加入聚丙烯酰胺凝膠的上樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳分離蛋白。60 V電泳，待溴酚藍(lán)指示劑移至分界線時將電壓改為120 V，電泳時間為1.5～2.0 h。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜洗滌后置于含50 g·L-1脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1 h。然后用封閉液稀釋抗體，目的一抗(抗αβ-晶狀體蛋白鼠抗人單克隆抗體)稀釋度為15000，二抗(山羊抗鼠抗體)稀釋度為12000，內(nèi)參蛋白(GAPDH)稀釋度為15000。將PVDF膜與一抗孵育，4 ℃ 搖床過夜。次日取出PVDF膜，洗滌后與二抗孵育2 h。充分洗滌后，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法使免疫反應(yīng)條帶可視化，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察、拍照。檢測患者LEC中αB-晶狀體蛋白表達(dá)，每個樣本重復(fù)測3次，取平均值。

1.2.3 觀察指標(biāo)αB-晶狀體蛋白在細(xì)胞中表現(xiàn)為綠色團(tuán)塊樣或顆粒樣染色物質(zhì)，每張鋪片隨機(jī)取10個視野，評價其染色強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞比例，染色強(qiáng)度根據(jù)無著色、淡綠色、綠色、深綠色分為0分、1分、2分、3分，陽性細(xì)胞比例根據(jù)≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分別定義為0分、1分、2分、3分、4分；兩項評估總分≥3分為陽性表達(dá)。對于Western blot檢測結(jié)果，通過ImageJ軟件量化相對條帶強(qiáng)度，αB-晶狀體蛋白條帶與GAPDH條帶的光密度比值為目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 一般情況98例患者中男44例，女54例。納入研究對象基本情況見表1。NDM組25例(25.51%),NDR組24例(24.49)%,NPDR組24例(24.49)%,PDR組25例(25.51%)，四組患者間年齡、性別、術(shù)前最佳矯正視力(BCVA)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。所有患者術(shù)中、術(shù)后均無并發(fā)癥發(fā)生。

表1 納入研究對象基本情況

2.2 患者LEC中αB-晶狀體蛋白陽性表達(dá)率FITC綠色熒光表示αB-晶狀體蛋白的免疫活性，DAPI藍(lán)色熒光特異性地表示細(xì)胞核。免疫熒光染色結(jié)果顯示，αB-晶狀體蛋白在整個細(xì)胞(細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì))中均呈現(xiàn)彌漫的綠色熒光，說明LEC中存在αB-晶狀體蛋白的表達(dá)，而且可同時表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。NDM組、NDR組、NPDR組、PDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的陽性表達(dá)率逐漸升高(P<0.001)；與NDM組相比，NPDR組、PDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的陽性表達(dá)率均顯著升高(均為P<0.05)；PDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的陽性表達(dá)率高于NDR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而NDR組與NDM組、NPDR組與PDR組、NPDR組與NDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(圖1、表2)。

圖1 免疫熒光染色檢測各組患者LEC中αB-晶狀體蛋白表達(dá)(×400)

表2 四組患者LEC中αB-晶狀體蛋白表達(dá)比較

2.3 患者LEC中αB-晶狀體蛋白的相對表達(dá)量患者晶狀體前囊膜LEC中均存在不同程度的αB-晶狀體蛋白表達(dá)，顯示為相對分子質(zhì)量約22 000處的單一反應(yīng)條帶(圖2)。Western blot檢測結(jié)果顯示，NDM組、NDR組、NPDR組、PDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。NDR組與NDM組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與NDM組、NDR組相比，NPDR組和PDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，NPDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的相對表達(dá)量均明顯高于NDM組和NDR組(t=-6.725,-5.785,均為P<0.05)；而PDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的相對表達(dá)量均高于NDM組、NDR組、NPDR組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-12.348,-11.431,-5.130,均為P<0.05)(表2)。

圖2 Western blot檢測各組患者LEC中αB-晶狀體蛋白表達(dá)

3 討論

VEGF是目前所知最強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞選擇性促有絲分裂因子和血管生成因子，與DR新生血管形成聯(lián)系最緊密[1，14-15]。VEGF表達(dá)增加促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，增加血管通透性，促進(jìn)新生血管形成[16]。臨床上廣泛應(yīng)用抗VEGF藥物來抑制新生血管形成，從而改善DR或減緩其病程進(jìn)展[6]。然而，抗VEGF藥物給患者帶來顯著療效的同時，亦給患者造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，且最終無法避免患者永久性視力損失。αB-晶狀體蛋白是晶狀體中主要的蛋白成分之一，有體外研究發(fā)現(xiàn)其與眼內(nèi)新生血管形成有關(guān)[17-20]，然而尚未從臨床角度驗證αB-晶狀體蛋白與DR的關(guān)聯(lián)。故本研究通過檢測αB-晶狀體蛋白在不同階段DR患者LEC中的表達(dá)，探究其與DR的關(guān)系，試圖從臨床角度補(bǔ)充說明αB-晶狀體蛋白與視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管的關(guān)聯(lián)。

本研究探討了LEC中αB-晶狀體蛋白的表達(dá)與DR進(jìn)展相關(guān)性。免疫熒光染色結(jié)果顯示，αB-晶狀體蛋白的免疫活性表達(dá)于整個LEC(細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì))中，且兩者的熒光表達(dá)強(qiáng)度隨DR的加重顯著增強(qiáng)。但由于免疫熒光染色檢測技術(shù)的量化穩(wěn)定性欠佳，只可作為定性、定位的證據(jù)，所以我們并不能確定各組患者之間LEC中αB-晶狀體蛋白表達(dá)水平是否存在差異。進(jìn)一步的Western blot檢測了各組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，相較于NDM組和NDR組，NPDR組和PDR組患者LEC中αB-晶狀體蛋白的表達(dá)均顯著升高，且在PDR組患者LEC中表達(dá)保持較高水平(表2)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著DR的出現(xiàn)和進(jìn)展，患者LEC中αB-晶狀體蛋白表達(dá)上調(diào)，其作為VEGF的分子伴侶能更好地保護(hù)未折疊和聚合的VEGF，增強(qiáng)VEGF的作用，從而正反饋刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，促使眼內(nèi)新生血管生長，加速DR的發(fā)展。Kase等[19]利用氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變和脈絡(luò)膜新生血管的動物模型來研究αB-晶狀體蛋白在視網(wǎng)膜新生血管中的作用，結(jié)果顯示，與對照組相比，αB-晶狀體蛋白基因敲除小鼠眼內(nèi)血管生成減少53%。此外，有研究在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)現(xiàn)，αB-晶狀體蛋白和VEGF共定位，αB-晶狀體蛋白具有與VEGF強(qiáng)烈相互作用的序列(ACD)，對ACD序列進(jìn)行分析，證實αB-晶狀體蛋白保護(hù)未折疊和聚合的VEGF就是通過此序列完成的[18]。由此可見，本研究與先前學(xué)者體外研究得出的結(jié)果基本一致。

本研究結(jié)果表明，患者LEC中αB-晶狀體蛋白的表達(dá)與DR的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，隨著DR的出現(xiàn)和進(jìn)展，患者LEC中αB-晶狀體蛋白的表達(dá)增加。推測αB-晶狀體蛋白可能參與眼內(nèi)新生血管的形成，對DR的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。本研究從患者體內(nèi)取晶狀體囊膜，探究不同階段DR患者LEC中αB-晶狀體蛋白的表達(dá)，國內(nèi)外尚無類似研究。然而，本研究結(jié)論只能說明αB-晶狀體蛋白與DR的關(guān)系，而不能解釋αB-晶狀體蛋白參與新生血管形成的機(jī)制，因此未來需要更多的體外實驗來驗證。