張 俏 羅 影 劉學(xué)政

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)引起的視力進(jìn)行性損害與累及眼底的大量纖維血管增生以及視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡有關(guān)[1]。然而，僅僅干預(yù)微血管病變并不能阻止DR[2]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的死亡早于微血管損傷，這主要依賴于半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的細(xì)胞內(nèi)過程，抗凋亡治療可能是防治DR的潛在靶點[3-4]。TANK結(jié)合激酶1(TBK1)為一種多功能激酶，在細(xì)胞中發(fā)揮廣泛功能，包括先天免疫、凋亡和炎癥信號等[5]。研究顯示，TBK1能抑制衰老過程中由受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)驅(qū)動的細(xì)胞凋亡和炎癥[6]。而DR亦屬于神經(jīng)退行性疾病范疇，TBK1可能在DR中具有重要作用，目前具體機(jī)制尚未完全清楚。因此，本研究擬探討TBK1的表達(dá)變化及其調(diào)控可能對糖尿病狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡的影響，為其對DR防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及模型制備雄性SD大鼠60只，體重220～240 g (購自錦州醫(yī)科大學(xué))。大鼠按60 mg·kg-1腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)，72 h后檢測尾靜脈空腹血糖，大于16.7 mmol·L-1者視為糖尿病模型造模成功。模型制備完成后，隨機(jī)分成三組：糖尿病(DM)組、TBK1過表達(dá)組(TBK1-OE組，大鼠玻璃體內(nèi)單次注射TBK1過表達(dá)慢病毒載體5 μL，病毒滴度為 1.0×109IU·mL-1)、TBK1空載體組(TBK1-NC組，玻璃體內(nèi)注射等劑量病毒包裝的陰性對照液)，另取正常大鼠作為對照(CON)組，每組15只。CON組、DM組大鼠灌胃等劑量PBS緩沖液。12 周后，進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.1.2 主要試劑及儀器STZ(美國Sigma公司)；TBK1 慢病毒(上海吉瑪公司，正義鏈：5’-AACCGTCTCATTAAGATAGC CGATCTTGGTGTGGC-3’； 反義鏈：5’-AACCGTCTCGAATTCTTAGCTCTGGC TGGCAC-3’)、兔抗大鼠TBK1一抗、小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)錄因子Brn3蛋白、兔抗大鼠RIPK1一抗、小鼠抗大鼠Caspase-3一抗 (英國Abcam公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA檢測試劑盒、Hoechst 33342染色試劑盒、山羊抗兔Alexa 488、山羊抗小鼠Alexa 594 (北京碧云天公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冰凍切片機(jī)(德國Slee公司)；水平電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本制作12 周后，每組取5只大鼠，40 g·L-1多聚甲醛灌注取出眼球并進(jìn)行冰凍切片，厚度為10 μm，用于免疫熒光染色及Hoechst 33342染色。再取5只大鼠提取視網(wǎng)膜組織，進(jìn)行ELISA實驗。每組余5只大鼠提取視網(wǎng)膜組織，剪碎超聲后 4 ℃ 離心30 min后取上清，進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.2 免疫熒光染色檢測各組大鼠視網(wǎng)膜TBK1蛋白表達(dá)定位切片用PBS洗滌3次，每次10 min；3 g·L-1Triton X-100孵育30 min,PBS洗3次，每次10 min；5 g·L-1山羊血清室溫孵育30 min，不洗；滴加兔抗大鼠TBK1 (1200)+小鼠抗大鼠Brn3a(1200)，4 ℃ 過夜，PBS洗3次，每次10 min；滴加二抗(山羊抗兔Alexa 488+山羊抗小鼠Alexa 594)，室溫60 min，PBS洗3次，每次10 min；用含DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡拍照。

1.2.3 Hoechst 33342染色檢測各組大鼠RGC凋亡切片用PBS洗3次，每次10 min；滴加Hoechst 33342染色檢測，室溫5 min，PBS洗3次，每次10 min；抗熒光封片劑封片，熒光顯微鏡拍照。

1.2.4 ELISA檢測各組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量收集各組大鼠視網(wǎng)膜，每孔100 μL ，設(shè)復(fù)孔，按照大鼠 TNF-α、IL-6、IL-1β 的 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。酶聯(lián)免疫檢測儀在波長 450 nm 下測量光密度，獲取各組大鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.2.5 Western blot檢測各組大鼠視網(wǎng)膜TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量BCA法測定蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜后10 g·L-1BSA室溫封閉2 h；加入一抗[兔抗大鼠TBK1(12000),兔抗大鼠RIPK1(15000),小鼠抗大鼠Caspase-3(110 000)]，4 ℃孵育過夜，TBST洗4次，每次5 min；加入二抗2 h，TBST洗4次，每次5 min；顯影后ImageJ 軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，所有數(shù)值均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TBK1在RGC中的表達(dá)通過TBK1和Brn3a免疫熒光雙標(biāo)確定TBK1在RGC中特異表達(dá)，提示TBK1對視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用是通過RGC實現(xiàn)的(圖1)。

圖1 免疫熒光染色檢測各組大鼠RGC中TBK1的表達(dá) A:TBK1的陽性表達(dá) (綠色：Alexa 488熒光標(biāo)記)；B:Brn3a(RGC標(biāo)志物)陽性表達(dá)(紅色：Alexa 594熒光標(biāo)記)；C:DAPI染色(細(xì)胞核)；D:共存(A+B+C)。箭頭示陽性染色。

2.2 Hoechst 33342染色檢測各組大鼠RGC細(xì)胞凋亡與CON組RGC凋亡率[(2.15±0.54)%]相比，DM組、TBK1-OE組及TBK1-NC組RGC凋亡率[(8.26±0.83)%、(4.65±0.64)%、(8.42±0.86)%]均明顯增加(均為P<0.01)；與DM組相比，TBK1-OE組RGC凋亡率明顯降低(P<0.01)；而DM組與TBK1-NC組之間RGC凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 Hoechst 33342染色檢測各組大鼠RGC凋亡情況 A:CON組；B:DM組；C:TBK1-OE組；D:TBK1-NC組。箭頭示凋亡細(xì)胞。

2.3 ELISA檢測各組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量與CON組相比，DM組、TBK1-OE組及TBK1-NC組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量均明顯增加(均為P<0.01)；與DM組相比，TBK1-OE組TNF-α、IL-6、IL-1β含量均明顯降低(均為P<0.01)；而DM組與TBK1-NC組之間大鼠視網(wǎng)膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量

2.4 Western blot 檢測各組大鼠視網(wǎng)膜TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量與CON組相比，DM組及TBK1-NC組RIPK1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量均明顯增加(均為P<0.01)，TBK1蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(均為P<0.01)；TBK1-OE組以上三種蛋白相對表達(dá)量均增加(均為P<0.01);與DM組相比，TBK1-OE組RIPK1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(均為P<0.01)，TBK1蛋白相對表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；而DM組與TBK1-NC組之間TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(圖3，表2)。

圖3 Western blot檢測各組大鼠視網(wǎng)膜TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量 A:CON組；B:DM組；C:TBK1-OE組；D：TBK1-NC組。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量

3 討論

DR患者除了微血管損傷外，神經(jīng)結(jié)構(gòu)也明顯變化，而RGC是遭受損傷的主要成分[7]。與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥會導(dǎo)致RGC結(jié)構(gòu)的不可逆變化，主要是程序性細(xì)胞死亡。突變或外部因素的影響可能導(dǎo)致不受控制的增殖或細(xì)胞丟失，這會大大加重疾病嚴(yán)重程度[8-9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病12周后，大鼠RGC凋亡率明顯增加，提示造模成功，這為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

TBK1是一種多功能激酶，在細(xì)胞中發(fā)揮廣泛的功能，包括先天免疫、凋亡和炎癥信號等[5,10]。TBK1調(diào)控的細(xì)胞凋亡在多種疾病中具有關(guān)鍵作用[11-12]。本研究中，免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBK1在大鼠視網(wǎng)膜只表達(dá)于RGC內(nèi)，在糖尿病狀態(tài)下，視網(wǎng)膜TBK1表達(dá)明顯降低，RGC凋亡率明顯增加。應(yīng)用慢病毒載體對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜TBK1過表達(dá)后，RGC凋亡率出現(xiàn)明顯降低現(xiàn)象。這提示TBK1在糖尿病時介導(dǎo)RGC的凋亡。此外，進(jìn)一步檢測了大鼠視網(wǎng)膜炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量，糖尿病時三者含量均明顯增加，而給予視網(wǎng)膜TBK1過表達(dá)后，TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯降低，這說明TBK1不僅介導(dǎo)RGC凋亡，還抑制其炎癥反應(yīng)。在衰老和神經(jīng)退行性疾病模型中，亦發(fā)現(xiàn)TAK1可通過抑制疾病引起的神經(jīng)炎癥和凋亡發(fā)揮保護(hù)作用[6]，但具體機(jī)制尚未完全明了。

有文獻(xiàn)報道，TBK1的激酶活性可通過促進(jìn)阿爾茨海默病等多種神經(jīng)退行性變中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，在介導(dǎo)神經(jīng)炎癥和凋亡中起著核心作用[13]。而其中RIPK1可被TBK1直接抑制，這可直接促進(jìn)RIPK1依賴性凋亡[14]。細(xì)胞凋亡主要依賴于Caspase蛋白家族，這些蛋白積極參與炎癥過程和細(xì)胞凋亡。Caspase系統(tǒng)的細(xì)胞外激活通常源于特異性TNF-α受體的激活，其表現(xiàn)為Caspase-8蛋白的激活，隨后Caspase-3的激活啟動了凋亡機(jī)制[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病時RIPK1表達(dá)明顯增加，而給予TBK1過表達(dá)后，RIPK1表達(dá)明顯降低，同時RGC凋亡率明顯下降。這提示TBK1可能通過調(diào)控RIPK1表達(dá)介導(dǎo)糖尿病時RGC的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TBK1可降低RIPK1表達(dá)，這可明顯抑制糖尿病狀態(tài)下大鼠RGC凋亡和炎癥。但因糖尿病致病機(jī)制復(fù)雜，本研究仍存在一些不足，如未能對RIPK1進(jìn)行干預(yù)，從而觀察TBK1的功能改變，同時也未能應(yīng)用免疫共沉淀等技術(shù)驗證TBK1與RIPK1是否存在直接相互作用，這將在本課題的下一步計劃中繼續(xù)研究。