李鵬飛 王從玉 王思文 鮑思潔 孫誠浩 管懷進

流行病學(xué)研究顯示，至2050年年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)將占我國所有白內(nèi)障患者的78%，這對ARC的防治提出了嚴峻的挑戰(zhàn)[1]。然而，ARC的發(fā)病機制目前仍不清楚。目前研究表明，含氧自由基(ROS)的異常增高以及氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活所導(dǎo)致的晶狀體上皮細胞(LECs)損害和凋亡是ARC發(fā)病的病理基礎(chǔ)[2]。而ROS過度產(chǎn)生的后果主要是導(dǎo)致DNA的氧化損傷[3]。DNA氧化損傷修復(fù)不足將會導(dǎo)致LECs凋亡[4]。DNA聚合酶η(POLH)作為一種DNA氧化損傷修復(fù)基因，尚未見研究探討其對LECs內(nèi)DNA損傷修復(fù)和氧化應(yīng)激影響的機制研究[5]。為了深入探討POLH與ARC之間的關(guān)系，本實驗利用過氧化氫(H2O2)構(gòu)建LECs氧化應(yīng)激模型，通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達POLH基因，觀察其對LECs內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)以及凋亡的影響，以期從基因調(diào)控的角度探討ARC的發(fā)病機制，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2021年3月至9月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科住院并行白內(nèi)障超聲乳化術(shù)的ARC患者10例為ARC組，同時收集同期行玻璃體切割聯(lián)合透明晶狀體摘除術(shù)的黃斑前膜患者10例為對照組，收集所有患者的晶狀體前囊膜，提取總RNA，RT-PCR檢測并對比兩組患者晶狀體前囊膜中POLH的表達。其中，入選患者年齡為50～80歲，均排除合并其他眼部或全身疾病者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》原則，并經(jīng)過了南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的審閱和批準，所有參與者都簽署了書面知情同意書。

1.2 材料人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。細胞培養(yǎng)實驗耗材(DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶和細胞培養(yǎng)板)均購自美國Gibco公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實驗所需耗材以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，引物購自中國生工生物工程股份有限公司；POLH過表達質(zhì)粒購自中國PPL質(zhì)粒與蛋白共享庫；蛋白GAPDH抗體、熒光二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗)均購自中國ABclonal公司，蛋白免疫印跡實驗抗體BAX、BCL-2和γH2A抗體均購于英國Abcam公司。

1.3 細胞培養(yǎng)取出凍存的SRA01/04細胞進行室溫解凍后，1000 r·min-1離心10 min，加入配置的完全培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清和10 g·L-1青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)，重懸細胞團塊并轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，細胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，全程操作均在細胞超凈臺上進行。

1.4 H2O2處理細胞待培養(yǎng)瓶中的細胞密度達80%左右時，用Hanks液清洗細胞2次，加入適量的無菌PBS。隨機分組，H2O2處理濃度分別為0 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1、800 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.5 RT-PCR檢測根據(jù)Trizol試劑盒的步驟提取ARC組和對照組患者晶狀體前囊膜組織及各組細胞的總RNA。按照說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，RT-PCR法檢測各組POLH的表達，用2-△△Ct分析表達水平，實驗重復(fù)3次。POLH引物：上游為5’-GCTACTGGACAGGATCGAGTG-3’，下游為5’-CACCACCCTTCCATGATTTGTA-3’。GAPDH引物：上游為5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’，下游為5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染取5×105個細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞密度至60%～70%時進行轉(zhuǎn)染。隨機分為轉(zhuǎn)染OV-POLH組、轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒HA組和空白對照組。6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染組每孔加入10 μL Lipofectamine 3000和5 μL質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染OV-POLH組、轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒HA組分別加入POLH過表達質(zhì)粒和HA對照質(zhì)粒)，充分混勻后室溫孵育15 min；之后，放入培養(yǎng)箱中孵育6 h，取出后將細胞培養(yǎng)基更換為含有血清的完全培養(yǎng)基。空白對照組不做處理，和轉(zhuǎn)染組一起置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，提取RNA和蛋白用于后續(xù)實驗。

1.7 免疫熒光法檢測DNA氧化損傷將細胞接種在含有細胞爬片的24孔培養(yǎng)板中，待細胞密度至60%后，根據(jù)實驗設(shè)計分為空白對照組、H2O2+HA組(轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒HA培養(yǎng)48 h后，加入H2O2再孵育24 h)和H2O2+OV-POLH組(轉(zhuǎn)染POLH過表達質(zhì)粒培養(yǎng)48 h后，加入H2O2再孵育24 h)進行處理后，PBS洗3次，每次5 min；隨后加入500 μL 40 g·L-1多聚甲醛固定30 min；配制體積分數(shù)3% 胎牛血清+體積分數(shù)0.5% Triton X-100溶液，室溫封閉2 h；之后，根據(jù)γH2A抗體說明書配制1200的一抗反應(yīng)液，于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜；第2日取出復(fù)溫1 h后，PBS漂洗3次，每次5 min；避光配置熒光二抗反應(yīng)液(1250)，室溫下孵育2 h后，PBS漂洗3次，每次5 min；采用比例110 000的 Hoechst 避光孵育8 min后，PBS漂洗3次，每次10 min；采用熒光顯微鏡避光拍攝。

1.8 免疫印跡實驗檢測蛋白表達將分組處理后的細胞置于冰上，PBS清洗3次,每次5 min；之后，吸棄PBS，加入200 μL蛋白裂解液，冰上裂解10 min；用細胞刮將細胞刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 ℃裂解30 min，12 000 r·min-1離心20 min，提取蛋白上清；凝膠電泳(80 V轉(zhuǎn)120 V)分離蛋白；采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(250 mA，2 h)，將靶蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；5 g·L-1脫脂奶粉室溫下封閉2 h；參照目的抗體說明書將稀釋好的目的一抗POLH(11000)、BAX(11000)、BCL-2(1800)、Nrf2(11000)、Keap1(11000)和GAPDH(18000)稀釋液加入PVDF膜中，置于4 ℃冰箱孵育過夜。第2日，用TBST漂洗3次，每次5 min，之后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(二抗)進行室溫孵育2 h。最后加入顯影劑，置于暗室內(nèi)曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

1.9 TUNEL實驗檢測細胞凋亡首先將無菌細胞爬片放于24孔培養(yǎng)板，SRA01/04細胞計數(shù)后以2×105個接種于細胞爬片上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細胞密度至60%后，根據(jù)實驗設(shè)計分組為空白對照組和H2O2組，分組處理24 h后取出培養(yǎng)板，PBS清洗細胞；40 g·L-1多聚甲醛室溫固定細胞1 h；PBS 洗滌細胞3次，每次4 min；體積分數(shù)0.1% Triton X-100 冰上通透細胞5 min；根據(jù)說明書配置TUNEL檢測液，每個樣品加50 μL TUNEL 檢測液后，37 ℃孵育1 h；PBS 清洗細胞3次，每次5 min；避光條件下小心地將細胞爬片從孔中取出，將有細胞的一面倒扣于滴有封片劑的載玻片上，進行熒光檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用兩樣本t檢驗進行兩樣本間的比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ARC患者和體外細胞模型中POLH的表達

2.1.1 ARC患者晶狀體前囊膜組織中POLH mRNA表達變化RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組透明晶狀體前囊膜(1.00±0.22)相比，ARC組患者晶狀體前囊膜組織中POLH的mRNA相對表達量明顯下降，為0.38±0.62，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.22，P<0.000 1)。

2.1.2 H2O2處理后SRA01/04細胞中POLH的表達以及細胞凋亡情況免疫印跡實驗檢測結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2濃度梯度處理SRA01/04細胞后，在H2O2作用濃度為200 μmol·L-1時，POLH的表達量明顯比其他處理濃度下降，且與0 μmol·L-1時相比顯著下降，兩組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。隨著H2O2作用濃度的遞增，SRA01/04細胞中POLH蛋白相對表達量呈先下降后升高趨勢(圖1)。400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2處理后，細胞中POLH蛋白表達升高，推測可能是損傷性POLH蛋白的積聚現(xiàn)象所致，所以后續(xù)實驗細胞氧化損傷模型均采用200 μmol·L-1的H2O2處理濃度，孵育24 h。采用此濃度對細胞處理后，運用TUNEL實驗檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，H2O2組細胞凋亡染色明顯增多(圖2)。

圖1 免疫印跡實驗檢測H2O2濃度梯度處理SRA01/04細胞后POLH蛋白表達情況 **P<0.01，***P<0.001。

圖2 H2O2誘導(dǎo)的細胞氧化損傷模型中細胞凋亡變化

2.2 POLH過表達模型驗證RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒HA組相比，轉(zhuǎn)染OV-POLH組細胞中POLH mRNA相對表達量顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.000 1)，空白對照組與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒HA組細胞間POLH mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3A)。免疫印跡實驗結(jié)果也顯示，與其他兩組相比，轉(zhuǎn)染OV-POLH組細胞POLH蛋白表達水平顯著升高(圖3B)。因此，選取該條件作為后續(xù)功能實驗的POLH過表達模型。

圖3 構(gòu)建POLH過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞后在RNA和蛋白表達水平的驗證 A：RT-PCR檢測結(jié)果，ns示差異無統(tǒng)計學(xué)意義，****P<0.000 1；B：免疫印跡實驗結(jié)果。1：空白對照組；2：轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒HA組；3：轉(zhuǎn)染OV-POLH組。

2.3 過表達POLH對SRA01/04細胞的影響

2.3.1 DNA氧化損傷程度變化免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，H2O2+HA組細胞中γH2A綠色熒光染色明顯增加，表明H2O2對細胞內(nèi)的DNA產(chǎn)生了損傷；與H2O2+HA組相比，H2O2+OV-POLH組細胞的γH2A綠色熒光染色明顯下降(圖4)。上述結(jié)果表明，POLH的表達升高對SRA01/04細胞內(nèi)DNA的損傷起到修復(fù)作用。

圖4 POLH過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞后對細胞DNA氧化損傷的影響

2.3.2 細胞凋亡變化免疫印跡實驗檢測凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BAX的表達，結(jié)果顯示，與H2O2組和H2O2+HA組相比，H2O2+OV-POLH組細胞促凋亡蛋白BAX表達量明顯下降，而抑凋亡蛋白BCL-2表達則明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)(圖5)。

圖5 POLH過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞對細胞凋亡的影響 ****P<0.000 1，**P<0.01。

2.3.3 細胞抗氧化通路相關(guān)蛋白變化免疫印跡實驗檢測氧化應(yīng)激通路相關(guān)蛋白Nrf2和Keap1的表達，結(jié)果顯示，與H2O2組和H2O2+HA組相比，H2O2+OV-POLH組SRA01/04細胞中Keap1蛋白水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)；而轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Nrf2蛋白水平則明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)(圖6)。

圖6 POLH過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞對抗氧化通路的影響 **P<0.01，***P<0.001。

3 討論

研究顯示，隨著年齡的增長，人LECs內(nèi)的ROS不斷增多[6]。而ROS的大量生成會對細胞內(nèi)DNA造成一定的氧化損傷，若修復(fù)不及時就會誘發(fā)LECs的凋亡[7]。因此，前期多項研究證實，DNA氧化損傷修復(fù)基因(OGG1、ERCC6、WRN等)在ARC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的抗氧化和DNA損傷修復(fù)作用[8-10]。Xu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1基因(OGG1)在ARC中通過堿基切除修復(fù)方式修復(fù)DNA，減少LECs的凋亡；切除修復(fù)交叉互補基因6(ERCC6)可以通過核苷酸切除修復(fù)方式修復(fù)DNA[9]，同時研究發(fā)現(xiàn)，ERCC6還能夠與溶酶體膜蛋白VCP發(fā)生相互作用，進而影響自噬小體的降解，從而參與ARC的發(fā)生發(fā)展過程[10]。本研究所探討的POLH基因能夠編碼POLH[11]。而POLH屬于Y家族DNA聚合酶，已被證實是一種跨損傷合成的DNA聚合酶，能夠復(fù)制含有受損核苷酸序列的DNA[12]。目前尚未見研究證實POLH在ARC中的表達以及潛在的作用機制。

本研究首先在ARC患者晶狀體前囊膜組織樣本中檢測到POLH的表達明顯降低。已有研究表明，POLH表達下調(diào)可引起細胞DNA氧化損傷程度的明顯增加[13]。隨后，我們采用H2O2構(gòu)建的SRA01/04細胞氧化損傷模型進一步探討POLH的作用機制，以驗證POLH過表達后的細胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)情況，結(jié)果顯示，相對于200 μmol·L-1H2O2處理組，POLH能明顯修復(fù)遭遇H2O2損傷的DNA，進而有效減輕細胞內(nèi)部氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活。

氧化應(yīng)激過程需要一系列分子參與激活，當機體的抗氧化防御系統(tǒng)無法清除過量的ROS時，氧化應(yīng)激隨之發(fā)生[14]。Nrf2作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，在氧化應(yīng)激過程中承擔(dān)著重要的作用；其主要功能是通過與靶基因的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，誘導(dǎo)下游抗氧化因子的基因表達[15-16]。Wakabayashi等[17]認為，Keap1可以作為氧化應(yīng)激的傳感器參與體內(nèi)抗氧化反應(yīng)，并被證實作為Nrf2的負調(diào)節(jié)因子在Keap1缺陷的小鼠中發(fā)揮抗氧化作用，表明Nrf2-Keap1是主要的抗氧化防御機制之一。已知在生理條件下，Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域與其負調(diào)控因子Keap1結(jié)合于細胞質(zhì)，而Keap1能夠促進Nrf2泛素化降解來維持活性氧濃度的動態(tài)平衡；應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧促使Nrf2與Keap1解離并轉(zhuǎn)移Nrf2進入細胞核，與ARE結(jié)合，繼而激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)[18]。為了揭示POLH與H2O2誘導(dǎo)的LECs氧化應(yīng)激反應(yīng)之間的聯(lián)系，本研究通過構(gòu)建POLH的過表達細胞模型，觀察氧化應(yīng)激通路蛋白的表達變化，結(jié)果顯示，在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境下，當POLH的表達升高后，會明顯促進Nrf2/Keap1通路的激活，誘導(dǎo)細胞內(nèi)ARE的啟動，抵御ROS引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與此同時，在此模型的基礎(chǔ)上，本研究也檢測了細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達情況，其中抑凋亡蛋白BCL-2與促凋亡蛋白BAX表達失調(diào)是引發(fā)線粒體依賴的經(jīng)典細胞凋亡途徑[19]。結(jié)果顯示，POLH的表達升高能夠顯著抑制H2O2刺激后的LECs內(nèi)的BAX的表達，而BCL-2的表達則顯著升高?？梢姡琍OLH在LECs中不僅能夠增強DNA氧化損傷修復(fù)功能，減少LECs內(nèi)凋亡的發(fā)生，而且也能促進氧化應(yīng)激蛋白Nrf2的表達增加，從而激活細胞內(nèi)部的抗氧化反應(yīng)協(xié)同削弱氧化應(yīng)激刺激所帶來的細胞損害。

本研究首次證明POLH在ARC患者和H2O2誘導(dǎo)的體外細胞模型中的表達和作用機制。在H2O2誘導(dǎo)的細胞模型中，POLH能夠通過對損傷的DNA進行修復(fù)以及激活Nrf2-Keap1-ARE信號通路來抑制LECs的凋亡，進而延緩ARC的發(fā)生發(fā)展。