陳 蓉，張立新，萬利霞，周 虹，阮連國，張 麗，洪 可

隱球菌腦膜炎(cryptococcal meningitis, CM)是由隱球菌引起的機會性感染，與獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)(又稱艾滋病)密切相關(guān)[1]。全球每年因CM死亡的艾滋病患者約18萬，占艾滋病總死亡人數(shù)的15%。我國屬于艾滋病低流行國家，由于我國人口基數(shù)大艾滋病合并CM的患者較多。CM起病隱匿且臨床表現(xiàn)缺乏特異性，早期確診困難，易誤診，導致病死率及致殘率增加[2]。本文探討?zhàn)ひ嚎t復染法對艾滋病合并CM的診斷價值，為細胞病理學的微生物診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2016年10月～2019年12月武漢市金銀潭醫(yī)院存檔的128例腦脊液細胞涂片。選取其中同時有腦脊液真菌培養(yǎng)及墨汁染色，或隱球菌抗原檢測結(jié)果的首次送檢病例75例納入研究，其中36例為艾滋病合并CM作為CM組，39例艾滋病無腦膜炎或合并其他腦膜炎作為非CM組。非CM組中無腦膜炎18例，合并結(jié)核性腦膜炎4例，合并病毒性腦膜炎8例，合并神經(jīng)梅毒6例，合并腦梗塞3例。臨床診斷標準依據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準中艾滋病及艾滋病毒感染診斷WS293-2019》和2018年5月《中華內(nèi)科雜志》“CM診治專家共識”。

1.2 方法(1)真菌培養(yǎng)：無菌吸管吸取腦脊液1～2滴滴入肉湯培養(yǎng)48 h，后接種于沙保羅氏瓊脂平板(廣州凱林公司)，放入(35±1) ℃含5%～10%CO2的孵箱中孵育，2天后觀察；同時吸取1～2滴滴入沙保羅氏斜面培養(yǎng)基孵育1周。有真菌生長，則行真菌鑒定，任意一種陽性均為陽性。(2)腦脊液墨汁染色：取1滴腦脊液滴于干凈玻片上，滴1滴墨汁(珠海貝索公司)覆蓋腦脊液，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察，見透亮隱球菌，包括菌體和較寬的莢膜，或菌體出芽判為陽性。(3)隱球菌莢膜抗原檢測：采用美國Immuno-Myologics有限公司生產(chǎn)的隱球菌抗原檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)。(4)黏液卡紅復染：將已行劉氏染色，并滴加醫(yī)用石蠟油診斷后的腦脊液涂片流水稍洗，75%乙醇30 s脫色，水洗，染色步驟按“黏液卡紅染色液”試劑盒(珠海貝索公司)說明書操作。已復染的玻片每例由2位病理醫(yī)師分別判讀，作出3種判讀結(jié)果：陰性、陽性、不確定(1～5個紅色隱球菌)。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)和百分數(shù)表示，采用χ2檢驗進行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料36例艾滋病合并CM者，男性34例，女性2例，年齡21～74歲，平均38.8歲。患者以頭痛和(或)頭暈或意識障礙為最常見癥狀(88.9%，32/36)，其次是發(fā)熱(63.9%，23/36)和嘔吐(27.8%，10/36)；91.7%(33/36)的患者CD4+T細胞計數(shù)為每微升<100個，腦脊液壓力≥200 mmH2O占72.2%(26/36)；入院期間死亡或危重放棄治療的患者達25%(9/36)。

2.2 黏液卡紅復染鏡下特征腦脊液細胞涂片脫色后黏液卡紅復染背景較原劉氏染色背景干凈，隱球菌呈團片狀或散在分布，莢膜顯示鮮紅色，其輪廓清楚，呈大小不一的類圓形，可見葫蘆樣出芽，易與具有藍色細胞核的淋巴細胞等其他細胞鑒別(圖1～3)，病理醫(yī)師易判讀。復染玻片中紅染的隱球菌或棋盤樣成群，或一大一小相連出芽，或散在單個。

圖1 A.劉氏染色示隱球菌、淋巴細胞及雜質(zhì)均著藍色；B.黏液卡紅復染后隱球菌紅色，淋巴細胞藍色，背景雜質(zhì)不著色 圖2 A.劉氏染色示隱球菌不著色或著淺藍色，紅細胞灰色；B.黏液卡紅復染后隱球菌鮮紅色，紅細胞淡黃色 圖3 A.黏液卡紅復染示淋巴細胞中見一個紅色的隱球菌；B.黏液卡紅復染示棋盤樣分布的紅色隱球菌，見出芽，散在3個藍色淋巴細胞

陽性片整片隱球菌數(shù)量不低于10個，陰性片幾乎無紅色菌體干擾，所檢測的病例中未出現(xiàn)不確定病例。

2.3 不同染色結(jié)果的一致性分析75例腦脊液細胞涂片黏液卡紅復染診斷艾滋病合并CM的敏感性為94.4%(34/36)；特異性為100%(39/39)。腦脊液培養(yǎng)敏感性為77.8%(28/36)，特異性為100%。腦脊液墨汁染色敏感性為11.1%(4/36)，特異性為100%。其中65例同時有腦脊液隱球菌莢膜抗原檢測結(jié)果，其敏感性為96.2%(25/26)，特異性為100%(39/39)。腦脊液黏液卡紅復染同真菌培養(yǎng)相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；同隱球菌莢膜抗原檢測相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.90)；同墨汁染色相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.005，表1)。

表1 腦脊液黏液卡紅復染與真菌培養(yǎng)、墨汁染色及隱球菌莢膜抗原檢測的對比分析

3 討論

3.1 艾滋病合并CM的臨床表現(xiàn)及實驗室檢查CM是由隱球菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的炎癥性病變，其臨床癥狀無特異性，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、漸進性頭痛、精神和神經(jīng)癥狀，常與其他中樞神經(jīng)感染的癥狀重疊，易誤診[2-3]。與國內(nèi)文獻報道相似，本組36例CM中，主訴頭痛和(或)頭暈或意識障礙的患者最多；CD4+T細胞計數(shù)每微升<100個占91.7%，提示對于CD4+T細胞計數(shù)每微升<100個細胞，出現(xiàn)頭痛、頭暈或嘔吐的艾滋病患者，應行腰椎穿刺排除CM[3]。

2010年我國“隱球菌感染專家共識”指出，腦脊液墨汁染色、培養(yǎng)和隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗結(jié)果中的任一個陽性均可確診隱球菌中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染；同時，患者的臨床癥狀、體征和腦脊液常規(guī)、生化以及影像學檢查對診斷具有重要價值[4]。國內(nèi)文獻指出，腦脊液墨汁染色可以早期、快速診斷CM，但是診斷的敏感性不一，從首次的44%至多次檢驗的100%，常依賴于觀察者的經(jīng)驗和技術(shù)水平[2-3]。本組病例中腦脊液墨汁染色的敏感性偏低(11.1%)，回顧性分析發(fā)現(xiàn)該結(jié)果與實驗室分檢樣本量偏少和檢驗者經(jīng)驗不足有關(guān)。腦脊液隱球菌培養(yǎng)是確診CM的“金標準”，但培養(yǎng)耗時較長，敏感性亦較低，同時治療過程中培養(yǎng)結(jié)果轉(zhuǎn)陰較為迅速，并不能依此判斷隱球菌已經(jīng)完全喪失活力[2]。本組病例的腦脊液真菌培養(yǎng)敏感性為77.8%，稍高于國內(nèi)的文獻報道，應該與同一樣本雙培養(yǎng)有關(guān)[3]；培養(yǎng)出現(xiàn)7例假陰性，其中5例在外院疑似CM已行抗真菌治療，2例是多次行腦脊液培養(yǎng)后才證實為CM，提示抗真菌治療后會影響培養(yǎng)結(jié)果。腦脊液隱球菌莢膜抗原檢測對CM的診斷具有較好的敏感性，可用于早期診斷，但存在假陽性反應，也不能作為評估是否治愈的指標[3]，受限于病例數(shù)較少和條件限制，基層醫(yī)院多未常規(guī)開展該檢測。

3.2 腦脊液細胞涂片黏液卡紅復染的病理學診斷隱球菌在體外為無莢膜或僅有小莢膜，進入人體內(nèi)后很快形成厚莢膜，具有莢膜的隱球菌菌體增大，致病力明顯增強[4]。黏液卡紅染色是傳統(tǒng)的組織病理特殊染色方法，操作簡單，原理是卡紅與媒染劑鋁形成螯合物，其分子帶正電荷能與低密度的酸基質(zhì)如黏液類物質(zhì)結(jié)合呈紅色。隱球菌的莢膜屬于黏液物質(zhì)，能被卡紅染成紅色，陽性即可確診，其他真菌無黏多糖莢膜，所以黏液卡紅染色對隱球菌診斷具有特征性[5]。

腦脊液細胞涂片黏液卡紅復染后，玻片背景較原劉氏染色干凈，淋巴細胞及中性粒細胞胞核呈藍色，胞質(zhì)不著色或淡灰色，紅細胞呈淡灰色或淡黃色；隱球菌莢膜顯示鮮紅色，類圓形，輪廓清楚。涂片中隱球菌數(shù)量多時，呈棋盤樣成群成片分布，菌體大小不一，可見典型一大一小葫蘆樣出芽；數(shù)量偏少時，隱球菌三五成群或散在單個分布，大者比淋巴細胞大，小的不及中性粒細胞的單個分頁核。

復染后隱球菌易與腦脊液中的人體細胞及其他微生物鑒別。病理醫(yī)師易判讀，陽性片滿視野可見紅色菌體，部落樣成群分布，數(shù)量大；陰性片幾乎無紅色顆粒，紅細胞呈類圓形，著淡灰色或黃色，需注意鑒別；當全片出現(xiàn)少數(shù)散在紅色菌體樣顆粒，無典型出芽菌體時，需謹慎判讀，以防止污染后出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

3.3 黏液卡紅復染診斷CM的可信度和優(yōu)勢本組數(shù)據(jù)顯示，黏液卡紅復染診斷艾滋病合并CM具有較高的敏感性(94.4%)和特異性(100%)；其敏感性稍高于真菌培養(yǎng)，特異性同真菌培養(yǎng)和隱球菌莢膜抗原檢測，差異均無統(tǒng)計學意義；但明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的墨汁染色。

臨床診斷性抽取腦脊液樣本量少，送檢病理科的樣本僅能離心制片1張滿足常規(guī)細胞病理診斷，黏液卡紅復染利用已完成的細胞病理診斷涂片，不增加樣本或再次送檢，實現(xiàn)病理學對隱球菌腦膜炎的微生物診斷。當臨床初診為其他腦炎，未送檢隱球菌實驗室相關(guān)檢驗，或其他原因未實現(xiàn)CM的診斷時，細胞病理黏液卡紅復染可實現(xiàn)隱球菌微生物學補救性診斷。

綜上所述，艾滋病合并CM起病隱匿，臨床表現(xiàn)無特異性，基層醫(yī)院條件受限，及時診斷存在一定的困難[2]，腦脊液細胞涂片黏液卡紅復染可實現(xiàn)CM微生物學診斷，適合推廣應用。值得注意的是，臨床的早期判斷和腰椎穿刺、組織病理學、影像學、藥物觀察等多學科合作可使患者最大程度的獲益。