黃云霞，時(shí)杜娟，蒙玉娜，馬淑萍，黨春艷，李紅玲

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，約占NHL的40%[1-2]，多為原發(fā)性DLBCL，也可由惰性淋巴瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)化而來(lái)。硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)、硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)及還原型輔酶Ⅱ共同構(gòu)成了Trx系統(tǒng)，該系統(tǒng)可調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，是人類(lèi)細(xì)胞中重要的抗氧化蛋白[3]。近年，許多研究表明Trx系統(tǒng)與腫瘤的關(guān)系非常密切，其影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖、凋亡過(guò)程[4]。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是一種普遍表達(dá)的抑癌基因，在多種腫瘤組織中低表達(dá)。TXNIP可與Trx結(jié)合，抑制其抗氧化活性，從而參與細(xì)胞中的氧化應(yīng)激，同時(shí)參與調(diào)節(jié)體內(nèi)活性氧系統(tǒng)以及線(xiàn)粒體通路過(guò)程，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)Trx、TrxR-1及TXNIP在DLBCL中的表達(dá)，分析上述三種蛋白與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系，為DLBCL的臨床診斷、病情評(píng)估提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年1月～2021年6月甘肅省人民醫(yī)院診治的60例DLBCL，淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織20例。60例DLBCL患者年齡18～80歲，中位年齡54歲，男女比為3 ∶2。DLBCL組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合DLBCL診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡范圍16～80歲；相關(guān)臨床資料完整；初診患者，病理活檢前均未進(jìn)行任何放、化療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性感染性疾病患者；糖尿病患者；合并其他惡性腫瘤患者；阿爾茲海默癥患者；心血管疾病患者。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及方法Trx抗體、TrxR-1抗體和TXNIP抗體均為兔多克隆抗體，Trx抗體(稀釋比1 ∶250)和TXNIP抗體(稀釋比1 ∶500)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，TrxR-1(稀釋比1 ∶500)抗體購(gòu)自GeneTex公司。選取甘肅省人民醫(yī)院病理科存檔的組織蠟塊，切片后脫蠟、水化，采用免疫組化SP法檢測(cè)三種蛋白的表達(dá)。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定Trx和TrxR-1表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，TXNIP表達(dá)主要定位于細(xì)胞核。通過(guò)半定量法分析細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分：(1)按細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為(-)，1～5分為(+)，6～8分為()，8～12分為()。其中<1分為陰性，≥1分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)出現(xiàn)1

2 結(jié)果

2.1 DLBCL和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中Trx、TrxR-1和TXNIP的表達(dá)DLBCL中Trx和TrxR-1表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1、2)，TXNIP表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，而在DLBCL中表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖3)。DLBCL中Trx和TrxR-1的陽(yáng)性率分別為68.33%(41/60)、76.67%(46/60)，淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中Trx和TrxR-1的陽(yáng)性率分別為25.00%(5/20)、35.00%(7/20)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DLBCL和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中TXNIP的陽(yáng)性率分別為20.00%(12/60)、80.00%(16/20)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中Trx、TrxR-1及TXNIP的表達(dá)[n(%)]

圖1 A.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中Trx陽(yáng)性；B.淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中Trx陽(yáng)性，SP法 圖2 A.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中TrxR-1陽(yáng)性；B.淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中TrxR-1陽(yáng)性，SP法 圖3 A.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中TXNIP陽(yáng)性；B.淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中TXNIP陽(yáng)性，SP法

2.2 Trx、TrxR-1和TXNIP表達(dá)與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系Trx、TrxR-1和TXNIP的表達(dá)與DLBCL臨床分期和IPI評(píng)分有關(guān)(P<0.05)，Trx和TrxR-1在DLBCL中的表達(dá)亦與B癥狀有關(guān)，與患者年齡、性別、乳酸脫氫酶無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 Trx、TrxR-1及TXNIP蛋白表達(dá)與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 Trx、TrxR-1單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)DLBCL診斷的價(jià)值ROC結(jié)果表明，Trx與TrxR-1聯(lián)合檢測(cè)AUC為0.767，高于單獨(dú)檢測(cè)(表3)。

表3 Trx、TrxR-1單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷的價(jià)值

3 討論

DLBCL的發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，每年歐洲的發(fā)病率為3～4人/10萬(wàn)，美國(guó)的發(fā)病率約為4.68人/10萬(wàn)[7]。目前，DLBCL患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿和潑尼松(R-CHOP)，治療效果與分期、年齡、有無(wú)重大疾病和國(guó)際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)等各種因素有關(guān)。在DLBCL中，50%～60%患者對(duì)化療反應(yīng)良好，但部分患者因復(fù)發(fā)、耐藥等因素導(dǎo)致治療效果差[8]。因此，亟需尋求新的DLBCL治療靶點(diǎn)。

氧化應(yīng)激是生物體細(xì)胞在遇到各種應(yīng)激刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生高水平物質(zhì)，如活性氧、氮自由基等，各種氧化物導(dǎo)致的氧化速度超出了機(jī)體的抗氧化能力，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷人體組織，氧化應(yīng)激的本質(zhì)即體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡。幾乎所有腫瘤細(xì)胞均有一個(gè)共性，即細(xì)胞內(nèi)氧化還原體系失衡[9-11]。Trx蛋白系統(tǒng)是人類(lèi)細(xì)胞中重要的抗氧化蛋白，由Trx、TrxR和NADPH組成，主要定位于細(xì)胞質(zhì)(Trx-1和TrxR-1)和相應(yīng)的線(xiàn)粒體(Trx-2和TrxR-2)。TrxR存在三種異構(gòu)體，除了細(xì)胞質(zhì)中的TrxR-1和線(xiàn)粒體中的TrxR-2，還有睪丸中的TrxR-3。TrxR-1的文獻(xiàn)報(bào)道較多，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)TrxR-1在DLBCL中的表達(dá)。根據(jù)癌癥的不同階段，Trx系統(tǒng)可在癌癥的發(fā)展中起雙向作用[12]。在癌癥發(fā)生早期，該系統(tǒng)的直接抗氧化功能可抵御致癌物引起的氧化應(yīng)激，從而預(yù)防正常細(xì)胞的惡變。然而，一旦出現(xiàn)腫瘤表型，TrxR/Trx表達(dá)水平的升高可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及影響患者預(yù)后[12-14]。因此，相對(duì)于非癌組織，TrxR/Trx在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)[15-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織相比，Trx、TrxR-1在DLBCL中的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織(P<0.05)，這與已報(bào)道的國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，DLBCL表達(dá)與患者臨床分期、IPI評(píng)分密切相關(guān)(P<0.05)。已有大量研究表明，TrxR/Trx的抑制劑具有抗腫瘤效果[19-21]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Trx系統(tǒng)作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，并為判斷患者預(yù)后提供參考。同時(shí)ROC結(jié)果表明，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)Trx和TrxR-1的表達(dá)也可為DLBCL診斷提供一定的參考價(jià)值。

TXNIP是一種抑癌基因，作為T(mén)rx的內(nèi)源性抑制劑，也被認(rèn)為是Trx的系統(tǒng)成員[22]。在正常生理?xiàng)l件下，TXNIP主要定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中也可少量分布。當(dāng)細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞核中的TXNIP會(huì)轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體中，與線(xiàn)粒體中的TRX2結(jié)合，從而釋放與TRX2結(jié)合的凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinases 1, ASK1)，激活A(yù)SK1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TXNIP在DLBCL中陽(yáng)性率明顯低于淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織(P<0.05)，其表達(dá)水平與DLBCL臨床分期及B癥狀有關(guān)。有研究表明，TXNIP在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與前列腺癌患者的惡性臨床病理學(xué)特征呈負(fù)相關(guān)[23]。另外一些研究結(jié)果亦表明，TXNIP在腫瘤組織或細(xì)胞中低表達(dá)[24-26]。這些研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測(cè)TXNIP可能在DLBCL發(fā)生、進(jìn)展中起負(fù)性調(diào)控作用。鑒于本組樣本量較少，可能會(huì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差，故需要大量樣本進(jìn)一步證實(shí)并明確其抗腫瘤機(jī)制，為DLBCL的治療提供新思路。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Trx和TrxR-1在DLBCL中高表達(dá)，可能參與了DLBCL的發(fā)生、發(fā)展，兩者聯(lián)合檢測(cè)為DLBCL的診斷提供一定的參考價(jià)值。TXNIP在DLBCL中低表達(dá)，提示TXNIP發(fā)揮腫瘤抑制作用，可進(jìn)一步探究TXNIP在DLBCL中的作用機(jī)制，為DLBCL的治療提供新思路。