趙雪可，李 威，劉 文，黃澤翎，曹 鴿，梁偉華，曹玉文,4

有氧糖酵解途徑是腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌特征性的代謝方式，多數(shù)腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)糖酵解活性和產(chǎn)生大量乳酸及快速生成ATP促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[1-4]。乳酸脫氫酶(LDHA)是無氧糖酵解途徑中催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的關(guān)鍵酶。文獻(xiàn)報道LDHA依賴性乳酸上調(diào)加速了乳腺癌的增殖、遷移和侵襲[5-6]。Subramonian等[7]的研究表明調(diào)控LDHA表達(dá)和功能與SUMO化修飾密切相關(guān)，鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌中SUMO化修飾水平顯著上調(diào)。本課題組前期應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)人乳腺癌組織中LDHA的SUMO化修飾程度明顯降低。本文著重探討LDHA在乳腺癌變過程中的表達(dá)和臨床意義，并驗(yàn)證LDHA的SUMO化修飾水平，為后續(xù)分析LDHA蛋白SUMO化修飾對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2000年1月～2010年9月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院存檔的乳腺癌旁正常組織127例(距癌組織>5 cm)、普通型導(dǎo)管增生97例、導(dǎo)管不典型增生51例、導(dǎo)管原位癌83例、浸潤性導(dǎo)管癌359例。手術(shù)切除后的新鮮乳腺癌組織和癌旁正常組織各取30例，所有患者均排除術(shù)前治療及伴發(fā)嚴(yán)重疾病?；颊呔炇鹬橥鈺⒔?jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批。乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和乳腺正常細(xì)胞MCF-10A購自上海復(fù)祥公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 石蠟切片依次二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、高壓微波抗原修復(fù)和3%雙氧水封閉。滴加LDHA抗體(稀釋比1 ∶1 000、Abcam ab52488)孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。免疫組化染色采用EnVision法，由兩位資深病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀結(jié)果。(1)按陽性細(xì)胞百分比計分：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)按染色強(qiáng)度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：得分范圍0～12分，>4分為高表達(dá)組，≤4分為低表達(dá)組。

1.2.2Co-IP和Western blot法 乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織或乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和乳腺正常細(xì)胞MCF-10A裂解液內(nèi)加入抗SUMO1(1 ∶30、Abcam ab32058)和抗IgG(1 ∶500、Proteintech b900610)抗體，Protein A/G agarose beads捕獲抗原抗體復(fù)合物，SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，滴加抗LDHA(1 ∶5 000、Abcam ab52488)及β-action抗體(北京中杉金橋公司)，然后添加二抗。Image Lab拍照并灰度掃描分析，LDHA與β-action條帶灰度比值作為LDHA相對表達(dá)量。

1.2.3在線數(shù)據(jù)庫分析LDHA mRNA表達(dá)、預(yù)測患者預(yù)后及篩選SUMO1結(jié)合位點(diǎn) Oncomine(https://www.oncomine.org)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫分析LDHA mRNA水平。Kaplan-Meier Plotter(http:// kmPlot.com/analysis/)預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后。GPS-SUMO(http://www.uniprot.org/)和SUMO plot Analysis Program(http://www.abgent.com/sumoplot)軟件對SUMO化位點(diǎn)進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 不同乳腺組織中LDHA蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，LDHA蛋白在癌旁正常乳腺組織、普通型導(dǎo)管增生、導(dǎo)管不典型增生、導(dǎo)管原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌的上皮細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的黃色顆粒(圖1)，陽性率分別為26.0%、26.8%、31.4%、54.2%、64.3%(表1)。癌旁正常乳腺組和普通型導(dǎo)管增生組中LDHA表達(dá)分別低于導(dǎo)管原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌組，差異有顯著性(P<0.001)，導(dǎo)管不典型增生組中LDHA表達(dá)低于浸潤性導(dǎo)管癌組，差異有顯著性(P<0.001)。

圖1 乳腺癌變過程中LDHA蛋白在癌旁正常組織(A)、普通型導(dǎo)管增生(B)、導(dǎo)管不典型增生(C)、導(dǎo)管原位癌(D)和浸潤性導(dǎo)管癌(E)中的表達(dá),EnVision法

表1 不同乳腺組織中LDHA蛋白表達(dá)[n(%)]

Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織和癌旁正常組織中LDHA的相對表達(dá)量分別為3.42±0.35、2.21±0.14，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.527，P=0.005，圖2)。乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中LDHA的相對表達(dá)量分別為1.32±0.06、0.82±0.03，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-12.915，P<0.001)。

圖2 Western blot法檢測乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中LDHA蛋白的表達(dá)

數(shù)據(jù)庫挖掘LDHA基因表達(dá)，通過Oncomine平臺分析389例乳腺癌組織和61例癌旁正常乳腺組織，結(jié)果顯示LDHA mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常乳腺組織(P<0.001，圖3)。GEPIA在線分析1 085例乳腺癌組織與291例正常乳腺組織，發(fā)現(xiàn)乳腺癌中LDHA mRNA水平高于正常乳腺組織，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。

圖3 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中LDHA mRNA的表達(dá)

2.2 LDHA表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LDHA蛋白表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)高分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM III+IV期和ER陰性相關(guān)(P均<0.05，表2)。

表2 LDHA表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，LDHA蛋白表達(dá)與乳腺癌患者總生存期(圖4A)、無瘤生存期(圖4B)及無復(fù)發(fā)生存期呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)，與再次進(jìn)展生存期無相關(guān)性(P>0.05)。

圖4 A.LDHA與乳腺癌患者總生存期的關(guān)系；B.LDHA與乳腺癌患者無瘤生存期的關(guān)系

2.3 LDHA蛋白SUMO化修飾Co-IP實(shí)驗(yàn)中，使用SUMO1抗體IP之后，乳腺癌組織中沉淀的LDHA蛋白表達(dá)量(183 868±4 213)與正常乳腺組織(300 599±18 254)相比下降(圖5A)，表明乳腺癌組織中LDHA和SUMO1的結(jié)合水平降低。乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞中沉淀的LDHA蛋白表達(dá)量分別為242 817±24 089和186 260±9 260(圖5B)，提示乳腺癌細(xì)胞中LDHA和SUMO1的相互作用減少。

圖5 LDHA蛋白與SUMO1在乳腺癌組織(A)和細(xì)胞(B)中的相互作用：Input.陽性對照；IgG.陰性對照

網(wǎng)站預(yù)測LDHA與SUMO1結(jié)合的賴氨酸位點(diǎn)，SUMOsp2.0顯示LDHA的SUMO化修飾位點(diǎn)28個，SUMOplot Analysis Program預(yù)測到3個SUMO1位點(diǎn)，依據(jù)P<0.05且Score得分越高的原則，共同篩選出LDHA蛋白可信度最高的3個賴氨酸位點(diǎn)(表3)。

表3 LDHA蛋白SUMO化修飾位點(diǎn)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LDHA蛋白從正常乳腺→浸潤性乳腺癌的癌變過程中，其表達(dá)呈逐漸升高趨勢，并且LDHA在癌旁正常乳腺組織、普通型導(dǎo)管增生組織中的表達(dá)分別低于導(dǎo)管原位癌和浸潤性導(dǎo)管癌，在導(dǎo)管不典型增生中的表達(dá)明顯低于浸潤性導(dǎo)管癌，與Western blot法及數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致，這亦與文獻(xiàn)報道LDHA mRNA[8-9]和蛋白在乳腺癌組織和細(xì)胞中均上調(diào)的結(jié)果一致[10]，提示LDHA分子在乳腺癌變階段發(fā)揮促癌作用，推測LDHA在乳腺癌中表達(dá)增多，可能與提高LDHA酶的催化作用，從而快速產(chǎn)生更多能量以供癌細(xì)胞增殖的機(jī)制相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LDHA高表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)高分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅲ+Ⅳ期和ER陰性相關(guān)，也有學(xué)者報道，LDHA表達(dá)升高的患者Ki-67表達(dá)更高、更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且分期更高[8,10-11]，說明LDHA蛋白促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)展。同時有文獻(xiàn)報道當(dāng)LDHA下調(diào)時則抑制了乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[9,12-13]，這與LDHA降低則減少乳腺癌細(xì)胞的乳酸生成量有關(guān)[13]，即通過干擾LDHA表達(dá)，降低了乳腺癌細(xì)胞的糖酵解從而抑制ErbB2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[13]，提示LDHA是發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床晚期的重要惡性表型標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)LDHA高水平的患者其生存期明顯縮短，這與文獻(xiàn)報道LDHA陽性者預(yù)后較差[10-11]的結(jié)果一致，提示LDHA可能是乳腺癌新的潛在預(yù)后分子標(biāo)志物。

LDHA表達(dá)和活性受到表觀遺傳學(xué)修飾的調(diào)控，SUMO化修飾是目前研究較多的一種翻譯后修飾，所謂SUMO化修飾即SUMO分子(最常見的是SUMO1)與底物蛋白特定賴氨酸殘基共價連接，調(diào)控靶蛋白表達(dá)、活性、定位、穩(wěn)定性等[14]，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生、進(jìn)展[7,15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常乳腺組織和乳腺癌組織中LDHA分子與SUMO1相互結(jié)合，說明LDHA可以發(fā)生SUMO化修飾，Wen等[16]報道前列腺癌細(xì)胞中LDHA是SUMO1分子的底物蛋白。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常乳腺中LDHA和SUMO1的結(jié)合水平明顯高于乳腺癌，與前期質(zhì)譜結(jié)果一致，提示LDHA的SUMO化修飾可能抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。然而，在鼠乳腺癌細(xì)胞中，LDHA的SUMO2/3修飾程度明顯低于轉(zhuǎn)移癌組[7]，與本組結(jié)果不一致。由此推測，這與LDHA結(jié)合不同的SUMO分子、在不同種屬以及乳腺癌不同階段發(fā)生的SUMO化修飾有關(guān)，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)檢測到LDHA蛋白有3個可信度最高的SUMO化位點(diǎn)K284、K59和K14，提示LDHA可能通過這3個位點(diǎn)與SUMO1結(jié)合從而調(diào)控LDHA表達(dá)和功能。因此，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這3個位點(diǎn)并探討對LDHA蛋白的影響。

綜上所述，LDHA在乳腺癌變及惡性進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，其高表達(dá)提示預(yù)后不良，并且LDHA蛋白發(fā)生SUMO化修飾。本實(shí)驗(yàn)仍需進(jìn)一步探討LDHA蛋白上具體賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生SUMO化修飾后，對LDHA蛋白表達(dá)及乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響。