聶佳琪，潘 鳳，李曉寧，崔?？担瑥埿駯|，楊 蘭，張文杰

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，每年全球新確診病例超過100萬[1]。能量代謝的重新編程和免疫逃避[2]是癌癥的兩個新興標志[3]。乳酸代謝中的關鍵酶——乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)常以LDHA和LDHB兩種不同的亞型存在，LDHA負責丙酮酸轉化為乳酸和NAD+，而LDHB負責將乳酸轉化為丙酮酸，促進氧化代謝[4]。在腫瘤細胞中，即使在氧氣充足的情況下，丙酮酸也易被LDHA催化成乳酸，稱為Warburg效應，也稱為有氧糖酵解[5]。增加Warburg效應可以促進腫瘤細胞增殖，通過合成代謝過程避免細胞凋亡[6]。值得注意的是，產生的乳酸會導致酸性腫瘤微環(huán)境的形成，這種低pH環(huán)境可影響腫瘤免疫監(jiān)測的各個部分，以驅動免疫逃逸[7]，因此，有必要探究LDH表達在胃癌中的臨床價值以及對免疫微環(huán)境可能產生的影響。雖然，目前已有大量的體外研究關注LDHA在胃癌中的調控作用，包括其上下游的靶向結合關系[8]，以及對糖酵解的影響[9]，但鮮有研究關注LDHB在胃癌中的作用以及預后價值。因此，本實驗重點探討LDHA和LDHB表達與胃癌患者預后的關系，并使用ssGSEA算法探究不同亞型對胃癌組織免疫微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集來源及預處理從TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫下載HTseq-FPKM格式的407例胃癌患者的轉錄組數(shù)據(jù)，對原始數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉化后，比較組織中LDH mRNA的表達。另外，從上述數(shù)據(jù)庫下載全體胃癌患者的臨床數(shù)據(jù)，對407例具有LDH表達信息的樣本與臨床信息進行匹配，最終納入375例具有完整LDH表達信息和臨床病理數(shù)據(jù)的胃癌標本。從HPA(https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫下載胃癌患者的LDH免疫組化染色圖片，其中LDHA染色包括11例正常人群及36例胃癌患者；LDHB染色包括12例正常人群及44例胃癌患者，對所有圖片使用Image pro plus軟件分析光密度值(IOD)。

1.2 生物信息學ssGSEA算法其根據(jù)每個樣本中全轉錄組數(shù)據(jù)的表達，計算每個基因的rank值，對24種免疫細胞的含量進行評估。24種免疫細胞包括aDC細胞、B細胞、CD8+T細胞、細胞毒細胞、DC細胞、嗜酸性粒細胞、iDC細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、NK CD56bright細胞、NK CD56dim細胞、NK細胞、pDC細胞、T細胞、輔助T細胞、Tcm細胞、Tem細胞、TFH細胞、Tgd細胞、Th1細胞、Th17細胞、Th2細胞和Treg細胞。

1.3 統(tǒng)計學分析采用R軟件v4.0版本進行統(tǒng)計學分析，Image pro plus軟件計算免疫組化染色的IOD值。采用t檢驗分析計量資料差異，采用χ2檢驗分析計數(shù)資料差異，采用Cox回歸模型篩選患者預后相關的獨立預測因素，采用Kaplan-Meier法進行生存分析并進行Log-rank檢驗。采用Pearson法進行免疫組化分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織及正常組織中LDHA和LDHB的表達與癌旁正常組織相比，胃癌組織中LDHA的mRNA表達量明顯上調(P<0.05，圖1A)。IOD半定量分析顯示，胃癌組織中LDHA蛋白表達量明顯上調(P<0.05，圖1B)，并且染色強度更深(圖1C)。另外，胃癌組織中LDHB的mRNA(圖1D)及蛋白表達量(圖1E)同樣明顯上調(P均<0.05)，且染色強度更深(圖1F)。

圖1 胃癌組織及癌旁正常組織中LDHA和LDHB的表達：A.LDHA mRNA的表達量；B.LDHA蛋白的IOD數(shù)值；C.LDHA的免疫組化染色，SP法；D.LDHB mRNA的表達量；E.LDHB蛋白的IOD數(shù)值；F.LDHB的免疫組化染色，SP法

2.2 LDHA及LDHB表達與胃癌臨床病理特征的關系以LDHA和LDHB表達的中位值作為截斷值，將全體患者分為高表達組(188例)和低表達組(187例)，發(fā)現(xiàn)LDHA表達與患者性別和年齡有關；LDHB表達與患者性別、T分期、病理分期、組織學分級有關(P均<0.05，表1)。

表1 LDHA及LDHB表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 LDHA及LDHB表達與胃癌患者總生存期(overall survival, OS)的關系LDHA高表達組患者的OS明顯短于低表達組患者(P<0.05)；LDHB高、低表達組患者的OS無明顯差異(P>0.05，圖2)。Cox回歸分析結果顯示，LDHA表達與患者年齡、M分期一樣，均是胃癌患者OS的獨立預后因素(P均<0.05，表2)。LDHB表達與患者OS無關(P>0.05)，但年齡和M分期仍是胃癌患者OS的獨立預后因素(P均<0.05)。

表2 Cox回歸分析患者OS的相關因素

圖2 A.LDHA表達與胃癌患者總生存期的關系；B.LDHB表達與胃癌患者總生存期的關系

2.4 LDHA及LDHB表達與胃癌患者無瘤生存期(disease-free survival, DFS)的關系LDHA高表達組患者的DFS與低表達組患者相比，差異無顯著性(P>0.05)；LDHB高表達組患者的DFS與低表達組患者相比明顯縮短(P<0.05，圖3)。Cox回歸分析結果顯示，LDHA表達與患者的DFS無關(P>0.05)，LDHB表達對患者DFS具有較強的獨立預后價值(P<0.05，表3)。

圖3 A.LDHA表達與胃癌患者無瘤生存期的關系；B.LDHB表達與胃癌患者無瘤生存期的關系

表3 Cox回歸分析患者DFS的相關因素

2.5 LDHA及LDHB表達對胃癌組織免疫微環(huán)境的影響LDHA表達與Th2細胞、NK CD56dim細胞、aDC細胞、Th1細胞、中性粒細胞、細胞毒細胞、巨噬細胞的含量呈正相關(P均<0.05)；與NK CD56bright細胞、嗜酸性粒細胞、pDC細胞、B細胞、肥大細胞、Tem細胞、Tcm細胞、TFH細胞以及NK細胞的含量呈負相關(P均<0.05)。僅NK細胞與LDHB表達呈負相關(P<0.05)；LDHB表達與Th2細胞、NK CD56dim細胞、aDC細胞、Th1細胞、中性粒細胞、細胞毒細胞、巨噬細胞、Treg細胞以及輔助T細胞含量呈正相關(P均<0.05，圖4)。另外，LDHB高、低表達組中有差異的免疫細胞數(shù)目較少。在不同LDHB表達的患者中，嗜酸性粒細胞、pDC細胞、輔助T細胞、Tem細胞、Th17細胞、Th2細胞的含量具有明顯差異(6/24)(P<0.05)。值得注意的是，在不同LDHA表達的患者中，大部分免疫細胞的含量差異均有顯著性(14/24)(P<0.05，圖5)。

圖4 A.LDHA表達與24種免疫細胞的相關性分析；B.LDHB表達與24種免疫細胞的相關性分析

圖5 A.LDHA高、低表達組與24種免疫細胞含量的差異分析；B.LDHB高、低表達組與24種免疫細胞含量的差異分析；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位居惡性腫瘤的第2位，病死率位居第3位，僅次于肺癌和肝癌[1]。在酸性環(huán)境中的腫瘤代謝重編程[10]與PD-L1等相關的免疫逃逸機制已被證明在胃癌中具有重要作用[11]。因此，本實驗著重探討導致腫瘤酸性環(huán)境關鍵酶的兩種亞型對胃癌的臨床價值以及對腫瘤免疫微環(huán)境的影響。

乳酸生成的增加和H+離子的積累，最終導致腫瘤微環(huán)境的酸化，目前相關研究已證明腫瘤組織中酸性環(huán)境與免疫反應之間存在密切聯(lián)系[12]。大多數(shù)情況下，酸性環(huán)境導致CD8+T細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞的活性下調，而促進調節(jié)性T細胞和骨髓源性抑制細胞的招募，從而刺激免疫抑制[13]。另外，相關研究支持LDH在腫瘤進展中的作用，如在C57BL/6小鼠胰腺癌模型成瘤實驗中，敲除LDHA表達后腫瘤大小小于對照組；在相同的模型中，LDHA敲低的腫瘤中NK細胞表現(xiàn)出更高的活性[14]。與此同時，黑色素瘤中LDH相關的乳酸積累被證明可以抑制T細胞和NK細胞對腫瘤的監(jiān)測作用，但有趣的是其抑制作用被認為涉及乳酸誘導的T細胞和NK細胞中NFAT的下調，從而減少了IFNγ的產生[15]。該結論提示，LDH活化可能在不同環(huán)境下同時具有促炎和抗炎作用。目前，LDHA在胃癌中表達的研究報道較多，如mTOR/PKM2和STAT3/C-Myc信號通路可降低LDHA的表達，并調節(jié)其能量代謝和腫瘤微環(huán)境[16]。且相關臨床研究結果亦表明，LDH的水平對胃癌患者預后有著較強的預測價值[17]，檢測化療前LDH水平也可預測中晚期胃癌患者姑息性化療預后[18]。同以往文獻報道一致，本實驗亦認為LDHA與患者預后密切相關，并且在OS中有著較好的獨立預測價值。另外本實驗確定了LDHA表達與Th2細胞、NK CD56dim細胞、aDC細胞、Th1細胞、中性粒細胞、細胞毒細胞、巨噬細胞的含量呈正相關；與NK CD56bright

細胞、嗜酸性粒細胞、pDC細胞、B細胞、肥大細胞、Tem細胞、Tcm細胞、TFH細胞以及NK細胞的含量呈負相關。這些結果也可為我們未來在LDH與免疫逃逸的基礎研究中提新思路。另外，不同LDHA表達的胃癌患者，其DFS結局差異無統(tǒng)計學意義。但隨后本實驗發(fā)現(xiàn)LDHB是胃癌患者DFS的獨立危險因素，其結果可作為LDHA的補充。遺憾的是，關于LDHB對胃癌組織中免疫微環(huán)境和預后價值的研究較少。但本實驗提供了該亞型對胃癌患者DFS的預后價值，并且揭示了LDHB表達對免疫細胞浸潤豐度的影響，包括嗜酸性粒細胞、pDC細胞、輔助T細胞、Tem細胞、Th17細胞、Th2細胞。這些結果提示，LDHB的表達可能同LDHA一樣，也具有一定的免疫調節(jié)價值。

目前，雖然胃癌中已有部分標志物的預后作用被深入研究，如SPIN1[19]、AXIN2[20]等,但本實驗對探究胃癌中乳酸代謝關鍵酶的關鍵作用提供了新思路。本實驗也存在一定的局限性：(1)根據(jù)美國公開回顧性數(shù)據(jù)集，LDH的預后效能可能還需國內病例數(shù)據(jù)進行下一步驗證。(2)由于該數(shù)據(jù)集缺乏統(tǒng)一的病理分型，未進行各病理亞型的分層分析，如傳統(tǒng)病理分型或分子亞型。雖然，ssGSEA算法在生物信息學領域已被廣泛應用，但仍需體外實驗驗證。另外，值得注意的是，本實驗雖然提示LDHA及LDHB表達對免疫細胞的影響，并且阻斷腫瘤乳酸代謝可能是腫瘤治療的另一種可以嘗試的途徑，但目前針對免疫細胞的治療方法具有強毒性，得出的某些實驗結果需謹慎應用。