黃建輝，蔣 晨，王興超，錢 飛

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別位居全球惡性腫瘤的第3位和第4位[1]。結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及環(huán)境影響、基因改變、宿主免疫等。文獻(xiàn)報(bào)道炎癥反應(yīng)和免疫紊亂在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-5]。高遷移率族蛋白-1(HMGB1)是DAMP家族的一員，細(xì)胞外HMGB1以兩種不同的方式發(fā)揮作用：通過炎癥細(xì)胞主動(dòng)分泌，或通過壞死或應(yīng)激細(xì)胞作為炎癥介質(zhì)被動(dòng)釋放。放療和化療會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡并促進(jìn)HMGB1的被動(dòng)釋放[6-8]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)可作為晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)的受體激活糖尿病誘發(fā)慢性炎癥[9]。研究發(fā)現(xiàn)，RAGE可導(dǎo)致包括HMGB1和S-100β在內(nèi)的多種分子的活化，在慢性炎癥的維持和炎癥介導(dǎo)的慢性疾病發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。RAGE對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)程中的炎癥微環(huán)境是否發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，尚無定論。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過人體標(biāo)本和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探究HMGB1-RAGE通路與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)分化的關(guān)系，初步探討HMGB1-RAGE通路在結(jié)腸癌進(jìn)程中可能的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2020年10月南通大學(xué)附屬醫(yī)院存檔的66對(duì)結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本及其癌旁組織，其中男性33例，女性33例；年齡45～80歲，中位年齡60.5歲；按組織類型分為高分化腺癌16例，中分化腺癌26例，低分化腺癌24例；按國際結(jié)腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期12例，Ⅱ期22例，Ⅲ期32例。臨床資料包括：患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤生長方式等。所有入組患者無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)前無放療和化療史、無其它惡性腫瘤病史。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑免疫組化SP試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔、鼠通用型二抗試劑盒購自DAKO Denmark生物科技公司，兔抗人RAGE多克隆抗體、鼠抗人FOXP3多克隆抗體購自Abcam公司。8周齡的SPF級(jí)Balb/C小鼠(雌、雄各半)來源于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。Mag Cellect Rat CD4+CD25+Treg分離試劑盒購自R&D公司。Anti-CD4(APC)、Anti-CD25(PE)和小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式檢測試劑盒均購自eBioscience公司。Anti-CD3和Anti-CD28購自BD公司。胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Solarbio公司。重組人細(xì)胞因子TGF-β購自Peprotech公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水、包埋、切片、脫蠟至水后用EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行高壓修復(fù)，隨后用0.3%H2O2作用10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再用10%胎牛血清封閉20 min，滴加一抗(稀釋比1 ∶200)并置于4 ℃冰箱過夜。第2天將切片用PBS清洗3遍后滴加二抗孵育30 min，PBS清洗3遍后滴加SP復(fù)合物反應(yīng)15 min。DAB顯色后，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，最后脫水，透明，封固。鏡下觀察并采集圖像進(jìn)行分析。

結(jié)果判讀：免疫組化結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行閱片，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，判定標(biāo)準(zhǔn)按照許良中等[10]的方法進(jìn)行。(1)按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分；1%～33%為1分；34%～67%為2分；68%～100%為3分。(2)按陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘作為最終評(píng)分：<2分為低表達(dá)，≥2分為高表達(dá)。

1.3.2免疫熒光 使用Pannoramic MIDI組織芯片掃描儀，通過HALO分析軟件，應(yīng)用Indica Labs-HighPlex FL模塊自動(dòng)識(shí)別，并設(shè)置組織切片上選定區(qū)域的綠光、紅光和共表達(dá)細(xì)胞。

1.3.3初始T細(xì)胞體外誘導(dǎo)iTreg 用無菌小鼠抗CD3、CD28單克隆抗體包被96孔板(用無菌PBS稀釋抗CD3和CD28抗體至終濃度CD3為10 μg/mL、CD28為4 μg/mL)，封口膜包裹96孔板4 ℃過夜，取出至37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱待用，分選的初始T細(xì)胞加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸至每毫升1×106個(gè)，加入IL-2(300 IU/mL)和不同濃度的重組人TGF-β1(10、20、30 ng/mL)，將包被的96孔板取出后PBS沖洗3遍，每孔加200 μL細(xì)胞懸液(約2×105個(gè)細(xì)胞)，置于37 ℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)60～108 h，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的iTreg比率。

1.3.4不同干預(yù)方式誘導(dǎo)iTreg效率比較 將分選初始T細(xì)胞分為2組，觀察組以TGF-β1聯(lián)合HMGB1共同刺激，對(duì)照組僅以TGF-β1刺激。利用流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的比例在HMGB1刺激后的改變，明確HMGB1對(duì)初始T細(xì)胞分化為iTreg細(xì)胞的影響。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中RAGE、FOXP3蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系RAGE表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，F(xiàn)OXP3在癌細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜、胞核均有分布，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒；在癌旁正常組織中，RAGE和FOXP3均僅表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中零星分散的棕黃色顆粒(圖1、2)。RAGE和FOXP3在低分化、浸潤層次深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期晚的結(jié)腸癌組織中表達(dá)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 RAGE、FOXP3蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

圖1 A.結(jié)腸癌組織中RAGE陽性；B.癌旁正常組織中RAGE弱陽性，SP法 圖2 A.結(jié)腸癌組織中FOXP3陽性；B.癌旁正常組織中FOXP3陰性，SP法

2.2 RAGE和FOXP3的免疫熒光檢測免疫熒光檢測結(jié)果顯示，RAGE(紅色熒光)和FOXP3(綠色熒光)在結(jié)腸癌組織中均呈高表達(dá)，分別約占75%和60%，并且兩者有明顯的共定位，提示兩者可能存在相互作用(圖3)。

圖3 免疫熒光法分析結(jié)腸癌組織中RAGE和FOXP3的表達(dá)和定位

2.3 不同濃度TGF-β1和不同時(shí)間刺激下iTreg的轉(zhuǎn)化率利用不同濃度的TGF-β1誘導(dǎo)生成iTreg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)的iTreg轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)79.1%；在不同時(shí)間下利用TGF-β1刺激誘導(dǎo)iTreg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺激96 h的iTreg轉(zhuǎn)化率最高，為81.2%(圖4)。

圖4 不同濃度TGF-β1和不同時(shí)間刺激下iTreg的轉(zhuǎn)化率：A.不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)iTreg的轉(zhuǎn)化率；B.TGF-β1刺激不同時(shí)間誘導(dǎo)iTreg的轉(zhuǎn)化率

2.4 HMGB1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的iTreg分化的影響利用TGF-β1刺激初始T細(xì)胞體外誘導(dǎo)96 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組iTreg的轉(zhuǎn)化率明顯高于對(duì)照組的iTreg轉(zhuǎn)化率(5.22%vs1.00%，P<0.05)，兩者差異有顯著性(圖5)。聯(lián)合HMGB1共同刺激后，TGF-β1體外誘導(dǎo)的iTreg轉(zhuǎn)化率增加(TGF-β1+HMGB1 9.16%vsTGF-β1 5.22%)，說明RAGE的配體HMGB1可以通過增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)iTreg的分化。

圖5 觀察組和對(duì)照組iTreg的轉(zhuǎn)化率

3 討論

RAGE蛋白是重要的炎癥因子，F(xiàn)OXP3蛋白表達(dá)賦予了T細(xì)胞免疫抑制活性，是CD4+CD25+Treg細(xì)胞重要的分子標(biāo)志物，也控制著CD4+CD25+Treg的發(fā)育和功能[11-13]，在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮免疫抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，RAGE和FOXP3蛋白在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期晚的結(jié)腸癌組織中的高表達(dá)率更高，說明兩者均與結(jié)腸癌的進(jìn)展密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)檢測，發(fā)現(xiàn)RAGE和FOXP3蛋白在結(jié)腸癌組織中存在著明顯的共定位，說明兩者可能存在一定的相互作用。

本組前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)：HMGB1-RAGE信號(hào)通路可以通過Ras依賴的方式激活下游Yap1轉(zhuǎn)錄因子，從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的進(jìn)程[14]。因此，作者推測HMGB1-RAGE信號(hào)通路可能通過FOXP3蛋白發(fā)揮促免疫耐受作用，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)展。

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)推測，課題組收集小鼠血液并利用免疫磁珠分離其中初始T細(xì)胞，以RAGE的配體重組HMGB1蛋白聯(lián)合TGF-β1刺激初始T細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的比例在HMGB1刺激后的改變，發(fā)現(xiàn)HMGB1可以明顯增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的Treg分化。FOXP3在腫瘤中的意義已得到初步證實(shí)[15]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HMGB1蛋白可以促進(jìn)CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的增加，而CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的增加會(huì)導(dǎo)致促免疫耐受作用。本組體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)了HMGB1-RAGE通路參與Treg分化的過程，潛在發(fā)揮促免疫耐受作用。

TGF-β1通路主要是在誘導(dǎo)初始T細(xì)胞(naive T cells)表達(dá)Treg關(guān)鍵分子叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的過程中發(fā)揮重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，RAGE作為炎癥相關(guān)信號(hào)通路，可與TGF-β相互作用促進(jìn)STAT5轉(zhuǎn)錄因子的活化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的周期和增殖[17]。TGF-β1通路在HMGB1-RAGE通路和Treg分化之間可能發(fā)揮介導(dǎo)作用。Treg受TGF-β1和IL-2等免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路控制，通過提高腫瘤細(xì)胞的免疫耐受而促進(jìn)腫瘤進(jìn)程[18-20]。HMGB1在一些實(shí)體腫瘤中表達(dá)均升高，包括鼻咽癌、肝癌、胃癌和結(jié)直腸癌[21-24]，與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，這些腫瘤的形成需要炎癥的觸發(fā)，Treg通過與腫瘤細(xì)胞直接作用，或通過樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤抗原遞呈和招募，Treg以誘導(dǎo)耐受和擊退抗腫瘤免疫反應(yīng)，在腫瘤誘導(dǎo)耐受中發(fā)揮重要作用[25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外的HMGB1可以通過與RAGE特異性膜受體結(jié)合，激活MAPK、NF-κB等關(guān)鍵信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[26-27]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)人體標(biāo)本和體外細(xì)胞兩個(gè)層面進(jìn)行研究，初步揭示了HMGB1-RAGE通路參與Treg分化的調(diào)控，潛在發(fā)揮促免疫耐受作用，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)腸癌的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)成果可能為新型抗結(jié)腸癌藥物的研發(fā)提供新靶點(diǎn)，然而本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，仍存在一些局限性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將增加樣本量進(jìn)行深入探究。