阮細(xì)玲，黃幼生，翁 陽，楊 丞，陳孟柚，胡嘉影，徐 恒

胃癌發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第5位，位居國內(nèi)惡性腫瘤的第3位[1]。近年來針對(duì)胃癌的免疫治療、新輔助治療等方法取得一定的療效，但晚期胃癌患者的病死率仍較高。目前，作用于特定靶點(diǎn)的小分子靶向藥物因其藥物不良反應(yīng)較輕、耐藥率低、患者服用方便等優(yōu)點(diǎn)成為晚期胃癌患者的新治療手段之一[2]，小分子靶向藥物依據(jù)作用機(jī)制分為抑制腫瘤血管增生和抑制腫瘤細(xì)胞增殖兩類[3]。

DNA聚合酶δ(polymerase deta, Polδ)是惟一與細(xì)胞周期相關(guān)且在DNA復(fù)制中起主導(dǎo)作用的DNA復(fù)制酶[3-4]，其催化亞基p125具有5’-3’聚合酶和3’-5’外切酶兩種活性，編碼該亞基的基因稱為POLD1。Polδ的催化亞基p125催化活性的提高與其表達(dá)調(diào)控異常有關(guān)[5]。

作為細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子，p21在細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。我們推測(cè)其可能參與了對(duì)POLD1基因的調(diào)控，本文將探究其可能的調(diào)控模式。通過對(duì)p21調(diào)控胃癌POLD1基因表達(dá)初步機(jī)制的分析，以探索基于降低POLD1基因表達(dá)并阻斷癌細(xì)胞惡性增殖的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料胃癌細(xì)胞株MGC-803購自中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所；pXJ41-neo載體由新加坡國立大學(xué)王躍教授惠贈(zèng)，pXJ41-p21i是將p21干擾質(zhì)粒的cDNA構(gòu)建入pXJ41-neo載體獲得的真核表達(dá)載體，由北京師范大學(xué)桑建利教授惠贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；高效真核轉(zhuǎn)染試劑Vigofect購自威格拉斯生物公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技公司；兔抗人p21抗體C19、山羊抗人Polδ(p125)抗體C20為Santa Cruz產(chǎn)品；遠(yuǎn)紅外熒光標(biāo)記的山羊抗兔及兔抗山羊二抗為美國KPL公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析p21與POLD1蛋白-蛋白互作關(guān)系(protein-protein interaction, PPI) String(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)是已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的在線數(shù)據(jù)庫，本實(shí)驗(yàn)通過String探討p21與POLD1 PPI，構(gòu)建關(guān)鍵的PPI網(wǎng)絡(luò)。隨后，利用生物信息學(xué)軟件Cytoscape 2.6對(duì)該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了映射，構(gòu)建了PPI模塊。

1.2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p21干擾質(zhì)粒 MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染前1 h給細(xì)胞換用無血清DMEM培養(yǎng)基。質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Vigofect 5 μg ∶3 μL比例制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，15 min后均勻滴入培養(yǎng)板細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后12 h便可在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染后24 h將細(xì)胞傳代轉(zhuǎn)種，用含200～400 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)直至篩選出陽性克隆。將實(shí)驗(yàn)分為3組：轉(zhuǎn)染p21干擾質(zhì)粒pGPU6/GFP/neo-p21i的803-p21i細(xì)胞；轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒pGPU6/GFP/neo-shNC的陰性對(duì)照組803-NC細(xì)胞；未經(jīng)轉(zhuǎn)染的胃癌MGC-803細(xì)胞為空白對(duì)照組803細(xì)胞。(1)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞周期因子的mRNA相對(duì)水平。應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因的引物序列(表1)。Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系：9 μL PCR mix、9 μL去離子水、1 μL引物、1 μL cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，PCR條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸31 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)，采用比較Ct法，7500 Software v 2.0.5分析數(shù)據(jù)。(2)Western blot法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞周期因子的蛋白表達(dá)水平。RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定濃度，加入上樣緩沖液煮沸5 min變性后上樣電泳。100 mA電流條件下轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃搖床孵育一抗(p21、p125一抗稀釋比分別為1 ∶500、1 ∶2 000)過夜，PBST洗膜10 min×3次，室溫孵育二抗(稀釋比1 ∶5 000)1 h，PBST洗膜10 min×3次，PBS洗1次(10 min)，最后用LI-COR Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描PVDF膜，Odyssey V 3.0軟件分析圖像及數(shù)據(jù)。

表1 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物序列

1.2.3免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析p21與p125的相互作用 (1)免疫細(xì)胞化學(xué)分析胃癌細(xì)胞MGC-803內(nèi)p125、p21蛋白定位：胰酶消化MGC-803細(xì)胞后用蓋玻片制作細(xì)胞爬片，DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后取出爬片，4%多聚甲醛固定爬片30 min，然后用中性樹膠將爬片的背面粘在載玻片上，正面滴加PBS以防干燥，用0.3%Triton X-100通透10 min，PBS洗滌，以非免疫山羊血清室溫下封閉30 min，置3%H2O2水溶液中室溫15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌3 min×3次。(2)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)：用IP裂解緩沖液(用前加入蛋白酶抑制劑Cocktail)冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000 r/min離心30 min后取上清，將蛋白濃度調(diào)整為1 μg/μL。將1 μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液中，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜。加入預(yù)處理的protein A/G-beads 4 ℃緩慢搖晃孵育2～4 h。免疫沉淀反應(yīng)后，4 ℃、3 000 r/min離心3 min，棄上清，用protein A/G-beads裂解緩沖液洗3次，PBS洗滌3次。加入2×SDS上樣緩沖液，沸水浴8 min進(jìn)行蛋白變性；12 000 r/min離心1 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中。SDS-PAGE電泳后進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)軟件分析p21與POLD1基因的關(guān)系生物信息學(xué)軟件Cytoscape、String分析結(jié)果顯示，p21與POLD1基因通過CDK2、PCNA而相互聯(lián)系(圖1)，亦與CDK4、CDK6、Cyclin E1、Cyclin D1、p53等細(xì)胞周期調(diào)控因子間接相關(guān)。

圖1 生物信息學(xué)軟件分析p21與POLD1基因之間的相互關(guān)系：A.p21(CDKN1A)與POLD1之間通過CDK2、PCNA相互聯(lián)系；B.p21(CDKN1A)對(duì)POLD1的調(diào)控與CDK4、CDK6、Cyclin E1、Cyclin D1、p53等細(xì)胞周期調(diào)控因子間接相關(guān)

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p21干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染p21干擾質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒12 h后便可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光(圖2)，表明轉(zhuǎn)染成功。

2.2.1相關(guān)細(xì)胞周期因子的mRNA表達(dá)水平 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組803-NC細(xì)胞、空白對(duì)照組803細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組803-p21i細(xì)胞的p21 mRNA低表達(dá)，而POLD1 mRNA表達(dá)上調(diào)。其他相關(guān)因子中，p53 mRNA表達(dá)受到抑制，CDK4、CDK2、PCNA的mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)p21低表達(dá)細(xì)胞的mRNA水平：實(shí)驗(yàn)組803-p21i細(xì)胞的POLD1、CDK4、CDK2、PCNA mRNA表達(dá)上調(diào)，p53 mRNA表達(dá)受到抑制

2.2.2相關(guān)細(xì)胞周期因子的蛋白表達(dá)水平 Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組803-p21i細(xì)胞的p125、CDK4、CDK2、PCNA蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組803-NC細(xì)胞、803細(xì)胞，p53蛋白表達(dá)水平則低于對(duì)照組803-NC細(xì)胞、803細(xì)胞，這與各基因?qū)?yīng)的mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化相一致(P均<0.05，圖4)。

圖4 Western blot法檢測(cè)p21低表達(dá)細(xì)胞的相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析p21與p125的相互作用

2.3.1免疫細(xì)胞化學(xué) 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，p125表達(dá)定位于胃癌MGC-803細(xì)胞胞核；p21蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖5)。

圖5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)p125、p21在胃癌細(xì)胞MGC-803中的表達(dá)：A.p125表達(dá)定位于細(xì)胞核；B.p21表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)；C.p21表達(dá)定位于細(xì)胞核，MaxVision法

2.3.2免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 分別用p21及p125抗體沉淀MGC-803細(xì)胞中提取的總蛋白，獲得的沉淀物進(jìn)行Western blot法檢測(cè)。用p21抗體沉淀時(shí)，沉淀物中檢測(cè)到p21蛋白，但未檢測(cè)到p125蛋白，反之用p125抗體沉淀時(shí)，檢測(cè)到p125蛋白，但未能檢測(cè)到p21蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均一致。表明p21與p125并無蛋白質(zhì)直接相互作用，或結(jié)合作用極弱未能被檢測(cè)出(圖6)。

圖6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析p21與p125的相互作用：圖左側(cè)為p125抗體沉淀總蛋白；圖右側(cè)為p21抗體沉淀總蛋白

3 討論

Polδ是真核生物DNA復(fù)制最重要的聚合酶之一，其由4個(gè)亞基組成，其中p125是其催化亞基，同時(shí)具有聚合酶和外切酶功能，p125的編碼基因?yàn)镻OLD1，其表達(dá)受到細(xì)胞周期的調(diào)控[3]。Northern blot實(shí)驗(yàn)顯示，Polδ mRNA表達(dá)水平在G1/S期升高了3倍。用Western blot法檢測(cè)Polδ調(diào)控蛋白水平也顯示在G1/S期達(dá)到峰值，其變化與mRNA水平的變化相似[6]。本期前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，POLD1在S期的啟動(dòng)子活性高于G2期或G1期，且在S期早期最高，表明POLD1啟動(dòng)子的活性受到細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控，在G1/S交界處發(fā)揮功能的周期相關(guān)蛋白可能對(duì)其活性調(diào)控尤為重要[7]。

p21是一種小分子量非結(jié)構(gòu)化蛋白質(zhì)，其可以通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶結(jié)合從而使其失活。有研究表明，S期p21的水平?jīng)Q定著DNA復(fù)制速度，以保持基因組的穩(wěn)定性[8]。所以p21曾被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子[9]，主要作用是抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制[10-13]。作者推測(cè)p21很可能參與了對(duì)POLD1的調(diào)控，并提出了兩種假設(shè)：(1)p21蛋白直接與POLD1編碼的蛋白質(zhì)p125相互結(jié)合，從而影響Polδ聚合酶功能的發(fā)揮。(2)p21不與p125相互作用，而是通過影響其他細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)從而間接地調(diào)控POLD1的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p125主要定位于MGC-803細(xì)胞胞核內(nèi)，這與p125在子宮頸癌及子宮頸上皮內(nèi)病變組織中的亞細(xì)胞定位一致[14]。最近也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)p125在子宮頸癌細(xì)胞株Hela中的表達(dá)定位可以在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間來回穿梭[4]。p21蛋白既可定位于細(xì)胞質(zhì)，也可定位于細(xì)胞核，定位于不同部位的p21可能發(fā)揮著不同的功能[15]。結(jié)合p21在胃癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位結(jié)果，作者認(rèn)為p21與p125蛋白間可能有直接相互作用。然而，本組的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)并未檢測(cè)到p125蛋白與p21蛋白直接相互作用。提示胃癌細(xì)胞MGC-803內(nèi)p21并未與p125直接結(jié)合，或者結(jié)合的量極其微弱，Western blot法未檢測(cè)及。據(jù)此作者認(rèn)為p21與p125不是通過蛋白-蛋白相互作用的方式影響Polδ復(fù)制全酶的形成進(jìn)而影響其DNA復(fù)制活性。

本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫String及軟件Cytoscape發(fā)現(xiàn)，p21與POLD1之間通過CDK2、PCNA而比較緊密地聯(lián)系起來，還與CDKs、Cyclin等細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)因子有關(guān)。

哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期是由細(xì)胞周期蛋白及其相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復(fù)合物驅(qū)動(dòng)的。細(xì)胞周期蛋白CDK的異常失調(diào)是癌癥的標(biāo)志[16]。CDK4/6在細(xì)胞周期的早期具有關(guān)鍵作用，CDK2在細(xì)胞周期后期起作用，并具有相當(dāng)廣泛的蛋白質(zhì)底物，其中一些是正常細(xì)胞增殖所必需的[17]，據(jù)此我們推測(cè)CDKs可能參與了p21對(duì)POLD1基因的調(diào)控。

PCNA是一個(gè)與DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)的蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)PCNA可以與Polδ的多個(gè)亞基相互結(jié)合，在Polδ催化亞基p125的N端存在和PCNA相互作用的保守區(qū)域-N2(N末端129-149位)，其含有一個(gè)PIP盒[18]。DNA復(fù)制時(shí)，PCNA與Polδ形成復(fù)制復(fù)合體，使前導(dǎo)鏈上連續(xù)的DNA復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行。而p21的N末端具有保守的CDK/Cyclin結(jié)合位點(diǎn)，C末端具有PCNA結(jié)合的位點(diǎn)，PCNA-p21復(fù)合物可以與多種CDK/Cyclin形成四聚體，使CDK活性被抑制[8]。

有研究表明，p53對(duì)G1期向S期的過渡非常關(guān)鍵，注射特異的p53單克隆抗體，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不能由G1期進(jìn)入S期[8]。Cyclin D-CDK4/6復(fù)合物在G1期與p21、p27相互作用，阻止CKI與Cyclin E/CDK2結(jié)合，從而阻斷G1期進(jìn)程[19]。最近有研究用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了210個(gè)預(yù)期受p53-p21-DREAM-CDE/CHR途徑調(diào)控的靶基因，大多數(shù)是G2期和有絲分裂的重要調(diào)節(jié)因子，包括細(xì)胞周期基因B-MYB(MYBL2)、BUB1、CCNA2、CCNB1、POLD1和RAD54L等基因。Fischer等[20]認(rèn)為p53阻滯G2/M細(xì)胞周期主要是通過p53-p21-DREAM-CDE/CHR途徑下調(diào)這些基因。

為探究p21是否通過這些相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控因子來間接調(diào)控POLD1基因，本實(shí)驗(yàn)建立p21低表達(dá)的胃癌細(xì)胞系，并檢測(cè)了POLD1、CDK2、PCNA的基因和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)POLD1、CDK2、CDK4、PCNA的表達(dá)水平與p21呈負(fù)相關(guān)，而p53則與p21呈正相關(guān)。這表明細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK2、CDK4、PCNA及p53均參與p21對(duì)POLD1的調(diào)控。另外，有研究者在POLD1啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)潛在的CpG島，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子E2F1可與這些位點(diǎn)結(jié)合，其結(jié)合親和力隨年齡增大而衰減，表明E2F1在衰老過程中可通過結(jié)合POLD1啟動(dòng)子而下調(diào)POLD1的表達(dá)[21]。那么p21是否通過E2F1而間接調(diào)控POLD1的表達(dá)仍需進(jìn)一步探究。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p21并非通過和p125蛋白-蛋白相互作用的模式調(diào)控POLD1基因，而是通過細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK2、CDK4、PCNA、p53等間接調(diào)控POLD1基因的表達(dá)，更深入的調(diào)控機(jī)制有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)深入探究。