焦紅麗，王珺嬈，胡敏萱，黃 元，丁彥青，冶亞平

結直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，病死率較高是導致患者死亡的主要癌癥之一[1]。近年來，全球范圍內(nèi)結直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡逐漸年輕化[2-3]。支架附著因子B(scaffold attachment factor-B, SAFB)屬于核蛋白家族成員，其通過直接或者間接與基因啟動子相結合，抑制相關基因轉錄，同時也是穩(wěn)定基因組3D結構的重要因素[4]，在人體組織中廣泛表達。本課題組前期實驗結果顯示，SAFB與結直腸癌的演進密切相關[5]，SAFB低表達可通過SAFB-TAK1-NF-κB信號軸發(fā)揮抑制結直腸癌演進的功能，但SAFB是否在結直腸癌的發(fā)生，尤其是增殖過程中發(fā)揮作用，以及發(fā)揮作用的具體分子機制尚不完全清楚。本課題組利用多種體內(nèi)外實驗結合公共數(shù)據(jù)庫分析，著重探討SAFB對結直腸癌細胞增殖能力的影響，并探討可能的分子機制，以深化對結直腸癌發(fā)生與演進機制的系統(tǒng)化研究，并為臨床結直腸癌的診斷與治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院存檔的結直腸癌石蠟標本175例和手術切除的新鮮配對結直腸癌樣本50對，配對樣本包括腫瘤組織和癌旁正常黏膜組織。所有標本均經(jīng)病理檢查確診為結直腸癌，所有患者均未接受放、化療。

1.2 細胞及試劑人結直腸癌細胞株HCT116、SW620、SW480和HCT15,均購自美國ATCC模式生物庫；慢病毒包裝質(zhì)粒購自上海吉凱公司；逆轉錄病毒表達載體pSUPER-retro-puro、慢病毒表達載體psin-EF2-puro及雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒為課題組自存。SAFB抗體購自美國Abcam公司；通用型SP試劑盒(SP-9000)、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物公司；RT-PCR主要試劑：Trizol購自Invitrogen公司，SYBR GREEN MIX購自日本TOYOBO公司，逆轉錄試劑盒購自日本TAKARA公司；0.25%胰酶、胎牛血清、DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、無酚紅DMEM培養(yǎng)基，均購自美國Gibco公司。

1.3 雙熒光素酶報告基因實驗細胞鋪板，待細胞長至60%左右匯合度時洗去含血清的培養(yǎng)基，加入預先配好的轉染液，37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，轉染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，分析信號通路活性情況。

1.4 穩(wěn)定細胞株的構建磷酸鈣法制備慢病毒、逆轉錄病毒，建立SAFB過表達、干擾穩(wěn)定細胞株，將含有重組質(zhì)粒SAFB/psin-EF2-puro、SAFB shRNA1、SAFB shRNA2及陰性對照質(zhì)粒psin-EF2-puro、pSUPER-retro-puro、慢病毒包裝質(zhì)粒及逆轉錄包裝質(zhì)粒的轉染液加入產(chǎn)病毒細胞293FT中轉染，轉染結束24～48 h后，用含1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選出轉染成功陽性細胞克隆，擴大培養(yǎng)，并收集以上細胞株的RNA和蛋白，采用RT-PCR和Western blot法進行鑒定。

1.5 裸鼠皮下成瘤實驗細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗3遍，調(diào)整細胞濃度為每毫升1×107個；1 mL注射器吸取細胞液用于裸鼠皮下注射接種，每只裸鼠注射200 μL細胞液(每只約2×106個細胞)，每組6只；隔天用游標卡尺測量1次腫瘤體積，腫瘤體積計算公式為體積=長度×寬度×高度/2；處死裸鼠并分離腫瘤組織后，置于10%中性福爾馬林中固定，24 h后進行蠟塊制作，切片，行HE及免疫組化染色。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)學分析，采用One-way ANOVA檢驗分析MTT、平板克隆實驗結果數(shù)據(jù)，檢驗時需要進行Levene方差齊性檢驗，若方差齊，采用Fisher方差分析進行整體比較，采用LSD-t檢驗進行組間多重比較，采用Dunnett法進行多個處理組和一個對照組的比較；若方差不齊，則采用近似F檢驗Welch法分析進行整體比較，采用DunnettT3檢驗進行組間多重比較。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達Oncomine(http://www.oncomine.com)及TCGA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)檢測結果顯示，結直腸癌組織中SAFB的表達水平明顯低于癌旁正常黏膜組織，且其表達量隨著臨床分期的增加呈下降趨勢(P<0.01，圖1A)?；蚋患治?gene set enrichment analysis, GSEA)結果顯示，在SAFB低表達組中出現(xiàn)結腸癌相關基因的顯著富集(P<0.001，圖1B)。RT-PCR檢測結果顯示，結直腸癌組織中SAFB mRNA表達水平均低于癌旁正常黏膜組織(圖1C)。

圖1 SAFB在結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中的表達水平：A.TCGA數(shù)據(jù)庫中SAFB表達與結直腸癌臨床分期的關系；B.GSEA分析SAFB表達下調(diào)后結直腸癌相關基因富集情況；C.RT-PCR定量分析結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB mRNA的表達

2.2 不同分期結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達免疫組化檢測結果顯示，SAFB表達主要定位于細胞核，呈棕紅色或黃褐色。SAFB蛋白在結直腸癌組織中的表達水平明顯低于癌旁正常黏膜組織，并且隨著Dukes分期的升高，SAFB的表達水平明顯下降(表1，圖2)。

圖2 不同分期結直腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中SAFB的表達，SP法

表1 SAFB表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

2.3 體內(nèi)、體外過表達SAFB對結直腸癌細胞增殖能力的影響MTT實驗、平板克隆實驗表明，SAFB過表達可抑制HCT116和SW620細胞的增殖能力(圖3)。裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示，SAFB過表達明顯抑制腫瘤細胞的生長速度(P<0.01，圖4A、B)；免疫組化結果顯示，SAFB過表達組腫瘤細胞的Ki-67增殖指數(shù)明顯低于對照組(圖4C)。流式細胞檢測結果顯示，SAFB過表達促進腫瘤細胞的凋亡(圖5)。以上體內(nèi)、體外實驗結果證明，SAFB通過促進細胞的凋亡抑制腫瘤的生長和增殖。

圖3 過表達SAFB對體外結直腸癌細胞增殖能力的影響：A.MTT實驗；B.平板克隆形成實驗

圖4 過表達SAFB對體內(nèi)結直腸癌細胞增殖能力的影響：A.裸鼠皮下瘤；B.皮下瘤增殖速度；C.皮下瘤HE染色與Ki-67增殖指數(shù)

圖5 過表達SAFB對細胞凋亡的影響

2.4 體內(nèi)外干擾SAFB表達對結直腸細胞增殖的影響MTT實驗、平板克隆及裸鼠皮下成瘤實驗均顯示，干擾內(nèi)源性SAFB表達促進腫瘤細胞的增殖能力(圖6、7)。流式細胞檢測結果顯示，SAFB過表達促進腫瘤細胞的凋亡(圖8)。以上體內(nèi)外實驗結果證明，SAFB低表達通過抑制細胞的凋亡促進腫瘤的生長和增殖。

圖6 干擾SAFB表達對體外結直腸癌細胞增殖能力的影響：A.MTT實驗；B.平板克隆形成實驗

圖7 干擾SAFB表達對體內(nèi)結直腸癌細胞增殖能力的影響：A.裸鼠皮下成瘤大體圖；B.皮下瘤增殖速度；C.皮下瘤HE染色與Ki-67增殖指數(shù)

圖8 干擾SAFB表達對細胞凋亡的影響

2.5 公共數(shù)據(jù)庫分析SAFB相關信號通路GSEA分析結果顯示，在SAFB低表達組中均出現(xiàn)Wnt信號通路相關基因的顯著富集(圖9)。

圖9 GSEA分析SAFB表達下調(diào)后相關基因富集情況

2.6 SAFB下調(diào)對Wnt信號通路的影響雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與對照組相比，干擾SAFB表達后Wnt熒光素酶活性升高(P<0.001，圖10A)。Western blot結果顯示，干擾SAFB表達后，Wnt信號通路下游關鍵基因Cyclin D1、non-p-β-catenin和LEF1表達明顯上調(diào)，而p21、p27表達明顯下調(diào)。相反，過表達SAFB后Cyclin D1、non-p-β-catenin和LEF1表達明顯下調(diào)，p21、p27表達明顯上調(diào)(圖10B)。免疫熒光染色結果顯示，干擾SW480細胞中SAFB表達后，β-catenin入核明顯增加(圖10C)。以上實驗結果證明，SAFB下調(diào)后可激活Wnt信號通路。

圖10 SAFB表達下調(diào)對Wnt信號通路的影響：A.雙熒光素酶報告基因實驗；B.Western blot法分析Wnt信號通路下游相關基因表達；C.免疫熒光顯示β-catenin入核情況

3 討論

結直腸癌的發(fā)生與演進是一個多因素、多步驟的復雜網(wǎng)絡調(diào)控系統(tǒng)，其常常伴有癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡調(diào)節(jié)基因和DNA修復基因的改變等。SAFB是一種在人體組織中廣泛表達的核蛋白家族成員，作為一種核基質(zhì)結合因子，通過N端DNA結合域(SAP/SAF-BOX)和C-端的轉錄抑制結構直接或者間接與基因啟動子相結合，抑制相關基因轉錄[4]。目前已知SAFB相關的生物學功能主要有：Xist調(diào)控的X染色體失活(Xist是X染色體失活的重要lncRNA)、細胞凋亡、DNA損傷反應、細胞應激反應、細胞增殖、RNA轉錄和加工[4,6-7]等。有研究表明，SAFB的基因改變與乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、演進及預后密切相關。SAFB通過抑制雌激素受體α(estrogen receptor alpha, ERα)和雄激素受體(androgen receptor, AR)的表達和活性，對乳腺癌和前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展起重要的抑制作用[8-9]。

本課題組前期實驗結果顯示，SAFB可以通過直接靶向TAK1抑制NF-κB信號通路的活性，從而抑制結直腸癌的侵襲和轉移，同時，實驗也發(fā)現(xiàn)，SAFB高表達后不僅抑制腫瘤的侵襲能力，同時也顯著抑制腫瘤的生長[5]。SAFB抑制腫瘤生長的具體機制、是否與NF-κB信號通路相關及是否有其他相關的分子機制參與的問題，需要我們開展后續(xù)的研究深入探究。

通過公共數(shù)據(jù)庫預測并進一步擴大樣本量檢測，實驗發(fā)現(xiàn)SAFB在結直腸癌中的表達顯著低于正常黏膜組織，且表達水平與腫瘤分期和分化等臨床病理特征密切相關，說明其很可能是結直腸癌發(fā)生與演進的重要預后標志物。此外，大量的體內(nèi)外實驗證實，SAFB可以明顯抑制腫瘤的增殖能力，促進其凋亡，但具體機制仍需深入探究。

Wnt/β-catenin信號能夠控制發(fā)育、維持干性以及通過調(diào)節(jié)細胞增殖與分化決定影響成體組織的穩(wěn)態(tài)平衡，該信號通路發(fā)生失調(diào)與多種腫瘤密切相關[10-11]。90%以上的結直腸癌患者攜帶Wnt信號途徑的體細胞突變，如APC腫瘤抑制基因失活等[12]，導致Wnt信號通路的持續(xù)性激活。本課題組通過前期生物信息學預測結合雙熒光素酶報告基因實驗和Wnt信號通路關鍵蛋白的表達等證實SAFB下調(diào)激活Wnt信號通路。免疫熒光檢測結果顯示SAFB下調(diào)可以促進β-catenin入核，表明SAFB低表達可以通過增強Wnt通路活性影響結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。結合本組前期實驗結果，作者認為在結直腸癌中SAFB低表達可以顯著影響NF-κB及Wnt等重要腫瘤相關信號通路的活性，NF-κB及Wnt信號通路也可能通過“交叉對話”的方式共同影響腫瘤發(fā)生與演進。同時，鑒于SAFB的重要功能，我們可以嘗試通過改變細胞內(nèi)SAFB表達水平或結合相應受體來調(diào)控相關信號通路，最終達到腫瘤控制與治療的目的。

長期以來，抑制RAS的膜結合被認為是一種合理的抗癌治療方法，因此可以通過應用法尼基轉移酶抑制劑進行抗癌治療。最近有研究表明，SAFB通過控制FNTA(由兩種異戊二烯基轉移酶共享的亞基)表達促進RAS膜結合。沉默SAFB來降低FNTA的水平，從而使KRAS和NRAS突變細胞對FTI抑制劑更敏感[13]，這為我們的研究工作提供了新的思路，當結直腸癌中SAFB表達降低時，應用FTI進行抗癌治療有望顯著提高治療效果。最近，一項關于黑色素瘤的相關研究表明，腫瘤細胞通過分泌大量的β-catenin阻止T細胞浸潤到腫瘤微環(huán)境中，從而減弱臨床免疫治療的效果[14]。在結直腸癌的聯(lián)合免疫治療中，我們可以嘗試通過調(diào)節(jié)SAFB的表達來改善晚期結直腸癌患者的腫瘤免疫微環(huán)境，以期提高聯(lián)合免疫治療的效果。

綜上所述，SAFB在結直腸癌組織中低表達，SAFB可能通過影響Wnt及NF-κB信號通路活性來影響結直腸癌細胞增殖與侵襲能力，這使得SAFB成為結直腸癌治療研究中的新目標。深入認識SAFB在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，充分了解其作用機制，可以為結直腸癌早期診斷及治療提供新思路。