閆慧敏， 楊 光， 楊 波， 王 禮

上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093

皮膚作為主要的外部防御系統(tǒng)，具有保護機體免受微生物感染的作用。每年都會有很多的病人因為各種事故導致表皮或皮膚出現(xiàn)不同程度的損傷［1］，因此敷料的選擇對損傷皮膚的修復至關重要。傳統(tǒng)敷料例如繃帶、藥棉和紗布等，都能不同程度的吸收傷口滲液，進行傷口管理［2］。同時傳統(tǒng)敷料也存在一些不可忽視的缺點，如紗布中的纖維容易脫落失去屏障保護功能，對傷口的愈合會產(chǎn)生一定影響；紗布無法有效吸收傷口滲出液，且換藥工作量大，換藥時由于傷口與紗布產(chǎn)生粘連，會引起疼痛和二次損傷。

近年來，越來越多的研究趨向于新型傷口敷料領域，新型傷口敷料能夠使受損皮膚表面含水量控制在合適的范圍內，既不會因為水分過多造成傷口感染，也不會因為過于干燥而影響傷口愈合或引起傷口粘連。新型傷口敷料包括水凝膠、薄膜類、藻酸鹽類、泡沫類、水膠體類敷料［3］等，其中水凝膠敷料是一種高分子聚合物，是一種以水為分散介質的凝膠［4］，具有在水中溶脹而不溶解并保持大量水分的特點，能夠為傷口提供濕潤的環(huán)境促進傷口愈合。此外，由于水凝膠特有的柔軟性能，使之能加工成各種形狀，從而與傷口更有效的接觸。因此，研究和開發(fā)水凝膠新型傷口敷料具有重要的商業(yè)價值［5］。

岳凌等人［6］采用冷凍-解凍法制備出一種加速傷口愈合水凝膠，在制作過程中摻入可局部應用于創(chuàng)面的慶大霉素。但慶大霉素屬于一種抗生素，且存在全身毒性（腎毒性）和低血漿濃度的問題阻礙了它的廣泛應用。PARK等人［7］采用水溶液澆鑄法以聚乙烯醇（PVA）為原料與戊二醛（GA）在鹽酸存在下進行化學交聯(lián)，制備了聚乙烯醇（PVA）水凝膠。但上述水凝膠均存在明顯的毒性，生物相容性差。目前，由于傷口愈合環(huán)境的特殊性，沒有一種單一的敷料能適用于所有的傷口管理，制備復合水凝膠是一種新的解決方法。

海藻酸鈉（Sodium alginate，SA）具有無毒、生物相容性好、能夠凝膠化和熱穩(wěn)定性強特點［8］。明膠（Gelatin，G）是膠原部分水解后的產(chǎn)物，在生物醫(yī)學、食品和化學工業(yè)中有廣泛應用。沙蒿膠（Artemisia sphaerocephala Krasch gum，ASKG）是一種天然植物膠，呈交聯(lián)結構［9］，具有良好的穩(wěn)定性、保水性和成膜性［10］，在組織工程方面具有潛在應用價值［11］?？咕阅苁撬z作為傷口敷料的一項重要指標，細菌感染會引發(fā)炎癥，從而延緩傷口愈合，ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種天然多肽抗菌劑［12］，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌等具有顯著的抑制效果，具有安全性能高，水溶性好，熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點［13］。本文采用共混-離子交聯(lián)法以海藻酸鈉、明膠、沙蒿膠為原料制備具有安全無毒復合水凝膠，并在此基礎上添加ε-聚賴氨酸進一步增強其抗菌性能，重點研究了ε-PL含量對復合水凝膠力學性能、溶脹性能、保濕性能、抗菌性能及溶血率的影響，進而評估該復合水凝膠在傷口敷料領域的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：明膠，分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；海藻酸鈉，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；沙蒿膠；西安拉維亞生物科技有限公司；ε-聚賴氨酸：上海阿拉丁試劑有限公司；無水氯化鈣，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌來源于上海大學實驗室自行分離保存。

主要儀器：Scientz-25T真空凍干機，寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ-1電動攪拌器，常州恩培精密儀器有限公司；SMS質構儀TA.XT PLUS，TA Instruments-Waters LLC；TM2101-T5型微電腦式拉力試驗機，濟南泰欽電氣有限公司；DHG-9240A型電熱鼓風干燥，上海一恒科學儀器有限公司；Nicolet is 10型傅里葉紅外光譜儀，美國產(chǎn)；FEI Quanta 450場發(fā)射掃描電子顯微鏡，美國FEI公司。

1.2 方法

1.2.1 復合水凝膠的制備

稱取一定質量的明膠于去離子水中，在50℃恒溫水浴鍋中攪拌40 min直至均勻，再向其中加入一定質量的沙蒿膠粉，攪拌均勻后制備混合液，之后加入一定量的ε-PL溶液攪拌均勻，pH調節(jié)為中性，制備混合液Ⅰ。稱取一定質量的海藻酸鈉放入去離子水中，在50℃恒溫水浴鍋中攪拌50 min，靜置均勻，制備混合液Ⅱ。之后將兩種等體積混合攪拌1 h，倒入模具中放入4℃冰箱過夜去除氣泡，然后向其中滴入等體積的2%氯化鈣溶液交聯(lián)8 h，最后用去離子水洗滌三次，即得復合水凝膠［11］。最終G質量濃度為2.5%、SA添加量為1.5%，ε-PL添加量分別為0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%，五組樣品依次命名為SGAP-0、SGAP-1、SGAP-2、SGAP-3、SGAP-4。

1.2.2 復合水凝膠力學性能的測定

（1）壓縮強度

在室溫條件下，用十二孔板制備直徑20 mm，高5 mm圓柱形水凝膠，用物性分析儀（TA.XT PLUS）對水凝膠試樣進行壓縮試驗直至壓破，壓縮速率設為0.5 mm／s。每組試樣重復五次壓縮試驗，以減少實驗誤差［14］。

（2）拉伸性能和斷裂伸長率

將制備好的水凝膠用裁刀切成啞鈴型，樣品總長度為75 cm，測試部位長度為40 mm，寬度為4 mm，用游標卡尺測量樣品厚度，將試樣的上下兩端夾緊到拉力試驗機上，以100 mm／min的拉伸速度拉伸并測定拉斷時的拉伸強度（KPa）和斷裂伸長率（%），每個樣品測試三次取平均值［15］。

1.2.3 復合水凝膠溶脹性能測試

將水凝膠于真空凍干機干燥至恒重，取大小、質量相近的干燥凝膠圓片，質量記為M0，將干燥后的凝膠圓片浸泡于去離子水中，每隔一段時間取出擦干表面水分后稱重，此時的質量記為Mt，根據(jù)公式（1）計算水凝膠的溶脹比SR（%）［16］，計算公式如下：

其中M0和Mt分別為干凝膠和t時刻水凝膠的質量g。

1.2.4 復合水凝膠的保濕性能測試

將冷凍干燥后的樣品質量記為m0，浸入去離子水中，充分溶脹后稱重，質量記為m1，將充分溶脹后的樣品放入37℃恒溫干燥箱中，間隔不同時間測量水凝膠的重量，記為mt。根據(jù)公式（2）計算各個時間點的保濕率［17］。保濕率計算方式如下：

其中m0、m1和mt分別為干凝膠、充分溶脹后的水凝膠和t時刻水凝膠的質量g。

1.2.5 紅外光譜測定

將制備好的水凝膠樣品于-45℃預凍4 h，置于真空冷凍干燥機中冷凍48 h后粉碎，利用KBr壓片法制得樣品進行測試，掃描范圍為4 000 cm-1～500 cm-1。

1.2.6 復合水凝膠的SEM測試

將水凝膠經(jīng)真空冷凍干燥后的樣品切片貼在導電膠上，待測樣品固定好后對其進行噴金處理，最后將噴金的樣品和載樣臺一同放入掃描電鏡的樣品室進行形態(tài)觀察。

1.2.7 復合水凝膠的抗菌性能測試

采用抑菌圈法和OD值法對樣品的抗菌性能進行測試。

抑菌圈法：先對細菌進行活化，然后用接種環(huán)取一環(huán)活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別于10 mL生理鹽水中制備菌體濃度為108CFU／mL的菌懸液，然后取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌100μL菌懸液均勻涂布于高溫滅菌處理過的瓊脂培養(yǎng)基上，將滅菌過的直徑為1 cm圓柱形樣品置于培養(yǎng)基上，在37℃溫度下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小。

OD值法：用接種環(huán)取一環(huán)活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉速220 r／min，溫度37℃，培養(yǎng)時間12 h，測量培養(yǎng)后的菌液在600 nm處的OD值，與LB液體培養(yǎng)基混合，稀釋至OD600為0.6左右，然后按1∶1 000比例繼續(xù)稀釋，稀釋至濃度約為105CFU／mL，將滅菌后的樣品加入到3 mL菌液中，使樣品完全浸沒在菌液中，設置不添加樣品的為空白對照，在220 r／min，37℃光照條件下培養(yǎng)24 h，測定此時600 nm處的OD值。按照公式（3）計算抑菌率。

其中，ODcontrastivegroups為對照組，ODexperimentalgroups為實驗組。

1.2.8 復合水凝膠的溶血率測試

按照抗凝兔血：0.9%生理鹽水4∶5制備稀釋新鮮抗凝兔血，取含有樣品的生理鹽水混懸液各10 mL于離心管中，在陰性對照中加入10 mL生理鹽水，陽性對照中加入10 mL去離子水。將全部離心管放于37℃水浴鍋中保溫半小時后，在各離心管中加入200μL稀釋過的新鮮抗凝兔血，保溫1 h，并以3 000 r／min速度離心5 min，取上清液用紫外分光光度計在545 nm處測其吸光度（OD），重復實驗三次。溶血率通過OD值按照公式4計算得出：

其中：ODt、ODpc、ODnc分別對照樣品組、陽性對照組和陰性對照組。

2 結果分析

2.1 ε-PL對復合水凝膠力學性能的影響

力學性能是水凝膠作為醫(yī)用敷料的一個重要指標，良好的力學性能能使敷料在使用過程中保持完整性，復合水凝膠的力學性能結果如圖1所示。

圖1（a）為應力-應變曲線，（b）為最大壓縮強度，可以看出，SGAP-1復合水凝膠壓縮強度達到最大值為477.6 kPa，隨著ε-PL質量濃度的增加，壓縮強度呈先增加后降低的趨勢。（c）、（d）分別為復合水凝膠的拉伸強度和斷裂伸長率，隨著ε-PL質量分數(shù)的增加，拉伸強度和斷裂伸長率均出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，這與壓縮強度一致。原因可能是隨著ε-PL的加入，ε-PL中的-NH2與SA和ASKG中的-OH分子間相互作用形成網(wǎng)絡結構［18］，使體系結合更加緊密，但隨著ε-PL的增加，使分子間-OH的距離增加，破壞了分子間作用力，導致力學性能下降。

圖1 ε-PL對復合水凝膠力學性能的影響

2.2 ε-PL對復合水凝膠溶脹性能的影響

水凝膠的溶脹是一個復雜的過程，首先水凝膠基質的極性親水基團被水化，水以一級結合水的形式出現(xiàn)，水也與暴露的疏水基團相互作用，疏水基團以二次結合水的形式出現(xiàn)。一次結合水和二次結合水都構成總結合水，之后網(wǎng)絡向無限稀釋方向的滲透驅動力受到物理或化學交聯(lián)的抵制，因此可以吸收額外的水充滿網(wǎng)狀或鏈狀空隙和較大孔隙的中心。良好的溶脹性能可以吸收傷口滲出液，有利于傷口的修復和愈合。ε-PL對復合水凝膠溶脹性能的影響見圖2。

圖2 ε-PL對復合水凝膠溶脹性能的影響

由圖2可知，加入ε-PL后，復合水凝膠的溶脹性能呈先降低后增加的趨勢，SGAP-0的溶脹率最大，隨著ε-PL的加入，溶脹度有所降低，原因可能是ε-PL的加入，使交聯(lián)網(wǎng)絡的密度增加，復合水凝膠體系較為致密，不利于水分子的進入，溶脹性能有所下降［19］，隨著ε-PL的繼續(xù)增加，SGAP-4的溶脹率有所增加，可能的原因是隨著ε-PL增加分子內氫鍵的距離增加，網(wǎng)絡孔隙變大，水分子能快速進入，使SPAP-4的溶脹性能有所增加。所制備的水凝膠溶脹度均在500%以上，具有較好的溶脹性能。

2.2 ε-PL對復合水凝膠保濕性能的影響

具有一定的保濕性能傷口敷料，可以為傷口的愈合提供一個濕潤的環(huán)境，進而加速傷口的愈合，ε-PL對復合水凝保濕性能的影響見圖3。由圖3可知，隨著ε-PL的增加，保濕率呈先增加后降低的趨勢，但整體變化趨勢不大，180 min后，復合水凝膠保濕率仍在35%以上，復合水凝膠中由于含有大量的親水基團，增加了水凝膠的潤濕性和親水性特征，容易與水結合，從而防止水分的蒸發(fā)，能夠為傷口愈合過程中提供一個良好的濕潤環(huán)境。

圖3 ε-PL對復合水凝膠溶脹性能的影響

2.3 紅外光譜分析

原料SA、G、ASKG和SGAP-0、SGAP-3的紅外光譜如圖4所示。由圖可知，海藻酸鈉光譜中在3 415 cm-1處有一寬峰是—OH的伸縮振動峰，在2 929 cm-1處出現(xiàn)的C—H的伸縮振動峰是海藻酸鈉的特征峰。在1 616 cm-1和1 413 cm-1處的吸收峰是羧酸鹽（COO—）對稱伸縮振動吸收峰［20］。明膠光譜中在1 618 cm-1和1 420 cm-1處出現(xiàn)的峰屬于酰胺I和酰胺II［21］，在沙蒿膠光譜中，在3 415 cm-1處出現(xiàn)—OH的寬峰是由于沙蒿膠內含有大量的羥基引起的［22］。在SGAP-0中，海藻酸鈉的羧基峰和明膠的氨基峰都明顯減弱，這是由于明膠中的氨基和海藻酸鈉中的羧基與鈣離子之間發(fā)生了交聯(lián)反應［23］，3 300 cm-1～3 600 cm-1范圍羥基峰形變的尖銳，其原因在于沙蒿膠中大量的羥基在體系中自身形成氫鍵使復合水凝膠體系間氫鍵作用力增強，ε-PL引入后，COO—在1 413 cm-1處的吸收峰明顯減弱，原因可能是ε-PL上的氨基與海藻酸鈉中的羧基在體系中發(fā)生了離子相互作用導致COO—的吸收峰有所減弱［24］。

圖4 復合水凝膠紅外光譜圖

2.4 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡觀復合水凝膠的三維網(wǎng)狀結構，將SGAP-0、SGAP-3和SGAP-4經(jīng)過真空冷凍干燥后切片、噴金后進行電鏡掃描，分別放大100倍和200倍進行觀察，結果見圖5。由圖可知，所制備的樣品均具有互相連接的孔狀結構且多孔結構之間的連通性較好，這是由于體系內的羥基形成大量氫鍵，增強了復合水凝膠中的網(wǎng)絡結構，可以為小分子提供良好的通路，使之能夠在網(wǎng)絡中得到良好的存儲，這為復合水凝膠的吸水和保濕提供了結構基礎［25］。ε-PL引入后可適當增加復合水凝膠的網(wǎng)狀孔結構，但隨著ε-PL的增加，水凝膠體系分子間距離增大，導致孔隙變大，使復合水凝膠的力學性能變差，與上文一致。

圖5 水凝膠掃描電鏡圖

2.5 抗菌效果評價

ε-PL的抗菌結果如圖6所示，由圖（a）可知，SGAP-0沒有抑菌圈出現(xiàn)，說明不具有抗菌性能，當加入ε-PL后，開始有抑菌圈的出現(xiàn)，且隨著ε-PL的增加抑菌圈越來越明顯，抑菌圈直徑越來越大。抑菌圈大小如圖（b）所示，從圖中可以看出，所制備的復合水凝膠具有優(yōu)異的抗菌性能。ε-PL對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率如圖（c）所示，隨著ε-PL的增加，抗菌效果越來越好，SGAP-3和SGAP-4均具有較好的抗菌效果，其中SGAP-3對大腸桿菌（E．coli）和金黃色葡萄球菌（S．a(chǎn)ureus）抗菌率分別達到了90.12%和88.35%。ε-PL是一種陽離子多肽，與細菌的細胞膜接觸可以增加細胞膜的通透性，并進一步導致細胞質泄露，進而殺死細菌。因此，添加ε-PL可以明顯增強水凝膠的抗菌能力。

圖6 ε-PL對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌

2.6 溶血率

對于醫(yī)用材料，一般用溶血率是否大于5%來判斷，如果大于5%，說明材料會引發(fā)溶血現(xiàn)象，導致機體受到一定傷害，不可以用作醫(yī)用材料，如果溶血率小于5%，說明材料對溶血的影響很小，不會發(fā)生溶血，可以用作醫(yī)用材料。由圖7可知，隨著ε-PL的加入，溶血率逐漸增大，原因可能是ε-PL是一種陽離子多肽，陽離子增多會破壞紅細胞的細胞膜，導致溶血率增大，但均小于5%，是一種非溶血性材料。

圖7 ε-PL對水凝膠溶血率的影響

3 結論

本文采用共混-離子交聯(lián)法制備水凝膠，并在此基礎上引入ε-PL增強其抗菌性能，研究了ε-PL對復合水凝膠力學性能、溶脹性能、保濕性能、抗菌性能和溶血率的影響，結果表明，當ε-PL添加量為0.5%時，制備的復合水凝膠出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，對大腸桿菌（E．coli）和金黃色葡萄球菌（S．a(chǎn)ureus）

抗菌率分別達到了90.12%和88.35%，證明其優(yōu)秀的抗菌性能。溶血率均低于5%，具有良好的力學性能可用作醫(yī)用材料。實驗證明本文采用的共混-離子交聯(lián)法制備的抗菌復合水凝膠在傷口敷料領域具有重要的應用價值。