王玲 李君 丁國祥 (青海省第四人民醫(yī)院 呼吸五科，青海 西寧 80000；檢驗(yàn)科)

肺結(jié)核俗稱肺癆，是結(jié)核病中最常見的一種慢性消耗性傳染疾病〔1〕。資料顯示，全球每年肺結(jié)核新發(fā)患者約800萬人，年死亡人數(shù)約140萬人，且其發(fā)病率與死亡率呈逐年上升趨勢，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一〔2〕。臨床顯示，肺結(jié)核主要是由結(jié)核分枝桿菌引起的，但結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制至今仍未完全清楚〔3〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在真核生物體內(nèi)表達(dá)廣泛，能夠參與機(jī)體遺傳調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄、翻譯等生物學(xué)過程〔4〕。LncRNA核富集轉(zhuǎn)錄體(NEAT)1是一種在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的LncRNA〔5〕。近期研究表明，肺結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中LncRNA NEAT1表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)情況與肺結(jié)核疾病的進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)〔6〕。但LncRNA NEAT1在結(jié)核分枝桿菌致病過程中的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚鮮有報(bào)道，本研究為進(jìn)一步分析LncRNA NEAT1與結(jié)核分枝桿菌感染的過程，通過分析LncRNA NEAT1在結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細(xì)胞中的表達(dá)情況，旨在探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 肺泡Ⅱ型細(xì)胞RLE-6TN(編號(hào)為BNCC337708)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；卡介苗(BCG)疫苗凍干粉購自北京生物制品研究所；RPMI1640完全培養(yǎng)液、羅氏培養(yǎng)基購自武漢純度生物科技有限公司；抗Toll樣受體(TLR)4、髓樣分化因子(MyD)88、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6、磷酸化(p)-核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抗體及抗β-actin抗體購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；RNA提試劑盒、蛋白提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將RLE-6TN細(xì)胞復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)入RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用1 ml(37℃)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1次，胰酶消化后，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)菌的制備 BCG疫苗每支用稀釋液進(jìn)行稀釋，接種于羅氏斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 w后，取生長良好的BCG于勻漿器中，加少量生理鹽水(0.05% Tween-80)研磨，以RPMI1640完全培養(yǎng)液稀釋成菌懸液，調(diào)整細(xì)菌濃度(5 mg/ml)。

1.2.3細(xì)菌感染 細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用，培養(yǎng)至6 孔板，胰蛋白酶消化后，RPMI1640完全培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，待細(xì)胞融合度至50%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，根據(jù)感染復(fù)數(shù)(MOI)，細(xì)菌數(shù)與細(xì)胞數(shù)之比的不同，加入終濃度為0.0、0.1、1.0、10.0 MOI重懸菌的RPMI1640完全培養(yǎng)液，每組細(xì)胞設(shè)置3組重復(fù)，將細(xì)胞置于(37℃、5%CO2)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用直接涂片抗酸染色鏡檢，結(jié)核桿菌呈亮紅色，結(jié)核桿菌數(shù)目≥3條/視野為細(xì)胞培養(yǎng)成功。分別在6、12、24 h時(shí)取對(duì)照組與重懸菌處理組的RNA、蛋白質(zhì)和培養(yǎng)液上清，以備后續(xù)檢測。

1.2.4qPCR檢測 NEAT1、miR-146a、TLRs信號(hào)通路相關(guān)分子及炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA的水平取上述各樣本提取RNA，檢測RNA濃度及純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得cDNA，采用qPCR試劑盒進(jìn)行NEAT1、miR-146a及TLRs信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA相對(duì)定量分析，反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件為95℃ 10 s、60℃ 20 s、70℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)，所有樣品重復(fù)測定3次。以β-actin作為內(nèi)參(miR-146a內(nèi)參為U6)，采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參及目的基因的引物序列見表1。

1.2.5Western印跡檢測TLRs信號(hào)通路及炎癥相關(guān)蛋白的水平 采用蛋白提取試劑盒提取上述樣本總蛋白，Lowry法進(jìn)行蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品實(shí)際濃度，用PBS將蛋白稀釋至同一濃度，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，封閉后，加入Ⅰ抗溶液，4℃孵育過夜，第2天室溫平衡30 min，用TTBS(0.1% Tween-20)洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)Ⅱ抗，在雜交盒中，室溫?fù)u床孵育1.5 h，PBS洗膜2次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，Quantity One凝膠成像分析軟件拍照并分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。每組均設(shè)3組重復(fù)，以β-actin作為內(nèi)參照。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA NEAT1在結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型RLE-6TN細(xì)胞中的表達(dá)情況 在相同MOI條件下，24 h時(shí)RLE-6TN細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)水平顯著高于0、6、12 h時(shí)(P<0.05)，12 h時(shí)RLE-6TN細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)水平顯著高于0、6 h時(shí)(P<0.05)，6 h時(shí)RLE-6TN細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)水平顯著高于0 h時(shí)(P<0.05)。在相同時(shí)間條件下，10.0 MOI組肺泡Ⅱ型細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)水平顯著高于0.0 MOI組、0.1 MOI組、1.0 MOI組(P<0.05)，1.0 MOI組的RLE-6TN細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)水平顯著高于0.0 MOI組和0.1 MOI組(P<0.05)；0.1 MOI組的RLE-6TN細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)水平顯著高于0.0 MOI組(P<0.05)，見表2。

2.2生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-146a是NEAT1下游的靶基因 SatrBase搜索生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，miR-146a是NEAT1下游的直接靶標(biāo)，見圖1。

表2 LncRNA NEAT1在結(jié)核分枝桿菌感染不同時(shí)間點(diǎn)RLE-6TN細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-146a是NEAT1下游的靶基因

2.3RT-qPCR檢測miR-146a及TLRs信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA的表達(dá)情況 以MOI=10.0的結(jié)核分枝桿菌感染RLE-6TN細(xì)胞，結(jié)果顯示，與0 h時(shí)相比，6、12、24 h 時(shí)RLE-6TN細(xì)胞中的miR-146a表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，MyD88 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，呈時(shí)間依賴性；TLR4 mRNA表達(dá)水平在6 h、12 h時(shí)顯著升高(P<0.05)，24 h時(shí)顯著降低(P<0.05)，NF-κB mRNA水平變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 感染不同時(shí)間點(diǎn)miR-146a及TLRs信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA表達(dá)情況

2.4TLRs信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白水平變化 與0 h時(shí)相比，6 h時(shí)RLE-6TN細(xì)胞中TLR4的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，12 h時(shí)顯著降低(P<0.05)，24 h時(shí)顯著升高(P<0.05)；6、12、24 h MyD88、TRAF6、p-NF-κB/NF-κB蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，呈時(shí)間依賴性，見圖2，表4。

圖2 RLE-6TN細(xì)胞感染結(jié)核桿菌不同時(shí)間TLRs信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白水平的變化情況

2.5RLE-6TN細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)情況 與0 h時(shí)相比，6、12、24 h時(shí)RLE-6TN細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，呈時(shí)間依賴性，見表5。

表4 感染不同時(shí)間點(diǎn)TLRs信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表5 感染不同時(shí)間點(diǎn)RLE-6TN細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α mRNA水平的比較

3 討 論

肺結(jié)核是全球范圍內(nèi)最重要的傳染疾病，肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中結(jié)核分枝桿菌是引起肺結(jié)核患者發(fā)病的首要因素〔7〕。結(jié)核分枝桿菌是一類典型的胞內(nèi)寄生菌，其感染過程中涉及固有性免疫與適應(yīng)性免疫，與抗原遞呈、細(xì)胞因子釋放等過程的機(jī)體免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)〔8〕。肺泡Ⅱ型細(xì)胞又稱為顆粒肺泡細(xì)胞，約占肺泡總數(shù)的75%左右，具有增殖、分泌肺表面活性物質(zhì)、維持肺泡內(nèi)外液體平衡及免疫調(diào)節(jié)等過程〔9〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肺泡Ⅱ型細(xì)胞在多種生理及病理?xiàng)l件下，能夠分泌多種細(xì)胞因子、炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)過程，與肺結(jié)核的發(fā)病過程密切相關(guān)〔10〕。

LncRNA結(jié)構(gòu)與mRNA相似，在真核生物體內(nèi)表達(dá)廣泛，能夠參與許多生物學(xué)過程及細(xì)胞活動(dòng)〔11〕。譚楊等〔12〕研究表明，巨噬細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌感染后，篩選出多種差異表達(dá)的LncRNAs，但未對(duì)這些LncRNA在結(jié)核病中的具體生物學(xué)機(jī)制進(jìn)一步研究。NEAT1是LncRNA中的一種，能夠參與機(jī)體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)〔13〕。Morchikh等〔14〕研究表明，NEAT1與HEXIM1能形成多亞基復(fù)合物，參與調(diào)節(jié)DNA介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果提示NEAT1表達(dá)上調(diào)可能參與結(jié)核分枝桿菌對(duì)肺泡Ⅱ型細(xì)胞感染過程。但具體生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。

本研究結(jié)果表明miR-146a是NEAT1下游的直接靶標(biāo)。miR-146a是最早證實(shí)與炎癥相關(guān)的miRNAs之一〔15〕。以上結(jié)果提示結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制可能與NEAT1對(duì)miR-146a的調(diào)控有關(guān)。孫波等〔16〕研究表明，胃黏膜組織中miR-146a可能通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)炎性反應(yīng)。TLRs是天然防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，其介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路在心肌損傷及心肌炎等一系列炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用〔17〕。馬渝等〔18〕研究表明，miR-146a在膿毒癥患者肺組織內(nèi)表達(dá)上調(diào)，可抑制TNFα釋放，減輕炎癥反應(yīng)。楊汀等〔19〕研究表明，miR-146a的作用靶點(diǎn)為TRAF6和IRAK-1的3′-UTR區(qū)，其能夠下調(diào)IRAK1和TRAF6水平。本研究結(jié)果提示TLR4可能在早期僅具有細(xì)胞識(shí)別作用，但整體上結(jié)核分枝桿菌感染RLE-6TN細(xì)胞能夠促進(jìn)TLR4的表達(dá)。結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞后，RLE-6TN細(xì)胞中NF-κBmRNA及蛋白表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其活化形式p-NF-κB蛋白水平顯著升高，呈時(shí)間依賴性，與TRAF6、MyD88 mRNA及其蛋白變化趨勢一致，提示結(jié)核菌感染細(xì)胞后可能會(huì)激活TLRs-NF-κB信號(hào)通路。本研究與郭茂等〔20〕研究結(jié)果一致。郭茂等〔20〕研究表明，右美托咪定處理膿毒癥小鼠外周血單核細(xì)胞后，細(xì)胞中miR-146a呈高表達(dá)，可明顯抑制小鼠炎癥因子TNF-α、IL-6水平，其機(jī)制可能與抑制TLR4-NF-κB信號(hào)通路中重要接頭蛋白TRAF6、IRAK-1表達(dá)有關(guān)。提示結(jié)核分枝桿菌感染RLE-6TN細(xì)胞過程中可能通過激活TLR4-NF-κB信號(hào)通，促進(jìn)促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)，導(dǎo)致感染發(fā)生。

綜上，LncRNA NEAT1在結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，NEAT1可能通過靶向miR-146a，參與調(diào)控TLRs信號(hào)通路活化及誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)。然而LncRNA NEAT1在結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細(xì)胞中的具體生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。