楊家軍，陳 明，宋春雷，王辰汝，杜振宇，劉國(guó)芳

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

我國(guó)食用菌栽培發(fā)展迅猛，目前已成為世界食用菌生產(chǎn)第一大國(guó)。工廠化栽培中，食用菌經(jīng)采收后，其培養(yǎng)料即成菌渣。每生產(chǎn)1 kg食用菌，會(huì)產(chǎn)生0.6 kg菌渣[1]。菌渣是秸稈、木屑等原料培養(yǎng)出食用菌的剩余物，也稱菌糠。菌渣中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分：如微量元素、礦物質(zhì)、菌體蛋白質(zhì)、多種代謝產(chǎn)物及未被充分利用的有機(jī)質(zhì)，是較好的堆肥原料[2]。但其通常也含有害物質(zhì)，如：青霉菌、白曲霉菌、黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵、鈣、汞、鉛、銅、鎘等。如直接用于飼喂動(dòng)物，會(huì)阻礙動(dòng)物生長(zhǎng)，降低生產(chǎn)性能[3-4]。因此，菌渣需適當(dāng)處理后，才能更好地飼喂動(dòng)物[5]。

益生菌為動(dòng)物體內(nèi)固有的微生物，主要包括芽孢桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌、放線菌等，具有提高機(jī)體免疫力、抗氧化水平、優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能等功效[6]。益生菌可被用于常規(guī)飼料的發(fā)酵，也可被用于青貯飼料如玉米秸稈、黑麥草、苜蓿、三葉草、紫云英等的發(fā)酵。物料發(fā)酵后，不僅改善了口感，還提高了可吸收蛋白質(zhì)、糖、氨基酸的含量，易被機(jī)體吸收。在物料發(fā)酵時(shí)，添加適當(dāng)?shù)囊嫔?，還可起到脫毒、分解轉(zhuǎn)化的作用[7]。

發(fā)酵制品生產(chǎn)后，如果貯藏方式選擇不當(dāng)，活菌數(shù)量會(huì)顯著降低，且易發(fā)生霉變。畜禽采食后，造成采食量下降，生長(zhǎng)速度減慢，飼料報(bào)酬率降低，甚至中毒，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的危害[3]。

本試驗(yàn)選擇枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌作為發(fā)酵菌種，添加到金針菇菌渣中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，檢測(cè)經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后樣品中消化酶活性、益生菌活菌數(shù)量、霉菌數(shù)量、磷元素含量、水分、黃曲霉毒素B1含量；評(píng)價(jià)金針菇菌渣固態(tài)發(fā)酵品質(zhì)；同時(shí)探究4種不同貯藏條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品活菌數(shù)量和霉變的影響，篩選出最佳貯藏方式，為金針菇菌渣的資源化和飼料化利用提供參考依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)菌種與菌渣

枯草芽孢桿菌和唾液乳桿菌菌種由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院益生菌教研組提供，專利保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC17718和14246；金針菇菌渣由南京金萬(wàn)辰生物科技有限公司提供。

1.1.2培養(yǎng)基制備

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、乳酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(MRS)，分別用于測(cè)定枯草芽孢桿菌數(shù)、霉菌數(shù)以及乳酸菌數(shù)。培養(yǎng)基按配方制備后，高壓滅菌，制備成平板，冷卻凝固后，倒置放入4 ℃冰箱，備用。

1.2 方法

1.2.1固態(tài)發(fā)酵

使用枯草芽孢桿菌和唾液乳桿菌混合菌種，進(jìn)行金針菇菌渣固態(tài)發(fā)酵。菌渣與菌種的接種比例為10∶6，發(fā)酵溫度34 ℃，需氧發(fā)酵20 h。發(fā)酵完成后，稱量發(fā)酵產(chǎn)品2 g，加入18 ml無(wú)菌生理鹽水，充分混勻，備測(cè)。

1.2.2貯藏方式

稱取100 g經(jīng)固態(tài)發(fā)酵的金針菇菌渣，裝入自封袋。根據(jù)飼料貯藏的3種因素：光照、溫度、密閉，設(shè)計(jì)4種貯藏方式：①室溫、不透氣、避光，②室溫、不透氣、不避光，③室溫、透氣、避光，④低溫、不透氣、避光。分用有孔灰色編織袋包裝設(shè)置為透氣包裝，無(wú)孔不透氣自封袋包裝設(shè)置為不透氣包裝。每個(gè)處理制作6個(gè)平行樣。樣品稱量后，按照4種方式進(jìn)行貯藏。未發(fā)酵的金針菇菌渣采用室溫、透氣、不避光保存，作為對(duì)照。在樣品貯藏7、15和30 d，分別取2 g樣品，加入18 ml無(wú)菌生理鹽水，充分混勻。備測(cè)。

1.2.3檢測(cè)方法

1.2.3.1水分和消化酶檢測(cè)

使用水分測(cè)定儀測(cè)定水分。蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按照說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行各消化酶測(cè)定。

1.2.3.2益生菌活菌數(shù)和霉菌計(jì)數(shù)

將樣品充分混勻后，分別取1 ml混懸液，加入9 ml生理鹽水，進(jìn)行倍比稀釋，至106倍稀釋后取100 μl，分別涂布在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MRS瓊脂、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上，用于計(jì)數(shù)枯草芽孢桿菌、唾液乳桿菌活菌數(shù)量和霉菌數(shù)量。

1.2.3.3固態(tài)發(fā)酵后益生菌形態(tài)鑒定

分別取純培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌、唾液乳桿菌和固態(tài)發(fā)酵計(jì)數(shù)時(shí)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌、唾液乳桿菌，先肉眼觀察菌種活化與計(jì)數(shù)培養(yǎng)所得細(xì)菌的菌落，2種情況是否存在差異；后用接種針，挑取菌落，采用革蘭氏染色，等待干燥、固定后，鏡檢，觀察形態(tài)差異[8]?？莶菅挎邨U菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，染色鏡檢呈紫色，桿狀；乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，染色鏡檢呈紫色，短桿稍細(xì)。

1.2.3.4鈣、磷和黃曲霉毒素B1測(cè)定

鈣測(cè)定采用鈣測(cè)試盒微板法，磷測(cè)定采用磷測(cè)試盒比色法，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；黃曲霉毒素B1采用ELISA法檢測(cè)[9]，試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，按照說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以“P<0.05”作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 固態(tài)發(fā)酵對(duì)金針菇菌渣營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

菌渣經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后，營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生了顯著變化(見(jiàn)表1)。水分顯著下降，由發(fā)酵前52.02%降至46.11%(P<0.05)。發(fā)酵后，枯草芽孢桿菌和唾液乳桿菌活菌數(shù)量分別達(dá)到2.1×109CFU/g和1.8×109CFU/g(P<0.01)；蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶活力水平顯著升高(P<0.01)，分別達(dá)到165.19、10.68、472.09、215.09 U/g。霉菌顯著下降(P<0.05)，由發(fā)酵前1.8×108CFU/g降低至9.8×106CFU/g(P<0.05)。黃曲霉毒素B1含量下降至0.043 pg/g(P<0.01)。鈣含量顯著下降，由19.93 mol/g降低至12.27 mol/g(P<0.05)；磷含量有下降趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

表1 營(yíng)養(yǎng)成分變化

2.2 固態(tài)發(fā)酵后益生菌形態(tài)鑒定

比較2種途徑下枯草芽孢桿菌的菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)一致，為干燥、褶皺、中型菌落。打開(kāi)平皿蓋，有特殊的蠟燭氣味。經(jīng)革蘭氏染色，均為藍(lán)紫色短桿狀，中間含有濃染芽孢體，如圖1所示。

圖1 枯草芽孢桿菌菌落形態(tài)與革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(100×)

同時(shí)比較了唾液乳桿菌純培養(yǎng)與固態(tài)發(fā)酵計(jì)數(shù)時(shí)唾液乳桿菌的形態(tài)，結(jié)果表明，菌落形態(tài)一致，為針尖狀、濕潤(rùn)、小型菌落。革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，球狀和短桿狀，如圖2所示。

圖2 唾液乳桿菌菌落形態(tài)與革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(100×)

2.3 不同貯藏條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的影響

采用4種不同的方式進(jìn)行貯藏。發(fā)酵產(chǎn)品在采取方式①貯藏3 d后，與其他組相比，水分顯著下降(P<0.05)，唾液乳桿菌和枯草桿菌數(shù)量無(wú)顯著變化(P>0.05)。方式③水分極顯著下降(P<0.01)，唾液乳桿菌和枯草桿菌數(shù)量無(wú)顯著變化(P>0.05)，霉菌數(shù)量顯著下降(P<0.05)。方式④唾液乳桿菌和霉菌數(shù)量都顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)表2。黃曲霉毒素B1含量，方式②最高(P<0.01)，其他3個(gè)方式之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

表2 貯藏3 d后4種貯藏方式下的微生物變化情況

發(fā)酵產(chǎn)品貯藏7 d后，結(jié)果見(jiàn)表3。與其他貯藏相比，方式①水分仍保持下降(P<0.05)，室溫保存的3個(gè)方式唾液乳桿菌和枯草桿菌數(shù)量無(wú)顯著變化(P>0.05)，與貯藏3 d相比，呈下降趨勢(shì)。方式③水分極顯著下降(P<0.01)，唾液乳桿菌和枯草桿菌數(shù)量皆無(wú)顯著變化(P>0.05)，而霉菌數(shù)量與其他組相比，顯著下降(P<0.05)。方式④乳桿菌和霉菌數(shù)量，皆為顯著降低(P<0.05)。黃曲霉毒素B1含量：方式②組最高(P<0.01)，方式①高于方式③和④組(P<0.01)，方式③最低(P<0.01)。

表3 貯藏7 d時(shí)4種貯藏方式下的微生物變化情況

發(fā)酵產(chǎn)品經(jīng)貯藏15 d后，結(jié)果如表4所示。方式①水分與7 d相比下降了2個(gè)百分點(diǎn)；唾液乳桿菌和枯草桿菌數(shù)量無(wú)顯著變化(P<0.05)。方式③水分極顯著低于其他組(P<0.01)，乳桿菌和枯草芽孢桿菌數(shù)量沒(méi)有發(fā)生顯著變化(P>0.05)，霉菌數(shù)量顯著低于其他組(P<0.05)。常溫保存的3個(gè)組，益生菌活菌數(shù)量與7 d相比，呈一定上升。方式④唾液乳桿菌、枯草芽孢桿菌和霉菌數(shù)量顯著低于其他組(P<0.05)。方式②黃曲霉毒素B1含量最高(P<0.01)。

表4 貯藏15 d后4種貯藏方式下的微生物變化情況

發(fā)酵樣品貯藏30 d后，結(jié)果如表5所示。方式①水分顯著低于方式②組；與貯藏15 d相比，無(wú)變化。唾液乳桿菌數(shù)量顯著高于方式②(P<0.05)。方式③水分最低(P<0.01)，枯草芽孢桿菌數(shù)量顯著高于其他組(P<0.05)，霉菌數(shù)量顯著低于方式①和②(P<0.05)。方式④唾液乳桿菌、枯草芽孢桿菌和霉菌數(shù)量與方式①和②相比，顯著下降(P<0.05)。方式①、③和④黃曲霉毒素B1含量極顯著低于方式②(P<0.01)。

表5 30天時(shí)四種貯藏方式下的三種菌的數(shù)據(jù)

3 討論

新鮮金針菇菌渣含水量高，容易霉變。故常使用固態(tài)發(fā)酵的方法進(jìn)行處理，從而減少水分，便于烘干。在選擇發(fā)酵菌種時(shí)，使用具有產(chǎn)消化酶的益生菌。益生菌利用金針菇菌渣中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生消化酶，降解金針菇菌渣中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供自身生長(zhǎng)繁殖需要；同時(shí)益生菌被動(dòng)物采食后，進(jìn)入消化道，其生長(zhǎng)繁殖時(shí)，所產(chǎn)生的消化酶可幫助機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，促進(jìn)吸收。此外選擇抗逆性強(qiáng)的菌株，菌體能夠在不利生存的環(huán)境下，仍能生存，提高了活菌數(shù)量，可增強(qiáng)發(fā)酵效果。

本研究選擇了2株獲得國(guó)家專利保藏的菌株：枯草芽孢桿菌和唾液乳桿菌，具有產(chǎn)消化酶和抗逆性強(qiáng)的特征[10-11]。在固態(tài)發(fā)酵完成后，產(chǎn)品中水分與發(fā)酵前相比顯著下降，說(shuō)明固態(tài)發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生熱量，使水分部分散發(fā)，便于貯藏[12]。由于益生菌繁殖生長(zhǎng)，發(fā)酵后產(chǎn)品中的蛋白酶、脂肪酶活力、α-淀粉酶、β-淀粉酶活力水平升高。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中這2株益生菌與原菌種進(jìn)行比較，經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)觀察，證明發(fā)酵產(chǎn)品中為原添加的2株益生菌生長(zhǎng)繁殖而形成。發(fā)酵產(chǎn)品中鈣含量顯著下降，而磷元素含量沒(méi)有顯著變化。

本著便于實(shí)際生產(chǎn)為目的，設(shè)計(jì)了4種不同的貯藏方式。結(jié)果表明，在貯藏7 d內(nèi)，益生菌可以利用金針菇中殘留的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，繼續(xù)緩慢生長(zhǎng)。貯藏時(shí)間為3～7 d，各貯藏處理組中，益生菌活菌數(shù)量呈現(xiàn)一定程度的下降。細(xì)菌的適宜生長(zhǎng)溫度為37℃，而室溫為20～25℃。室溫下不利于細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，菌體繁殖和死亡達(dá)不到平衡，此時(shí)益生菌繁殖生長(zhǎng)數(shù)量低于死亡數(shù)量，因此結(jié)果顯示兩種益生菌活菌數(shù)量下降。在7 d后，細(xì)菌通過(guò)降低自身代謝，適應(yīng)了貯藏環(huán)境，繁殖數(shù)量超過(guò)死亡數(shù)量，活菌數(shù)量上升。尤其是抗逆性強(qiáng)的芽孢桿菌[13]。

霉菌生長(zhǎng)時(shí)受到水分的影響，在一定范圍內(nèi)，水分越大，霉菌生長(zhǎng)越快；同時(shí)霉菌生長(zhǎng)受到益生菌生長(zhǎng)的抑制。在發(fā)酵起始過(guò)程，2種益生菌的接種數(shù)量大，快速的利用菌渣中的營(yíng)養(yǎng)成分，不斷生長(zhǎng)繁殖。益生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)，可有效分解菌渣原有的霉菌毒素，降低發(fā)酵菌渣中毒素含量，與先前報(bào)道一致[14]。另外，從微生態(tài)角度分析，在發(fā)酵過(guò)程中，大量的益生菌迅速建立優(yōu)勢(shì)菌群，明顯抑制霉菌的生長(zhǎng)繁殖，有效減少了霉菌毒素的產(chǎn)生。這兩方面，皆有利于發(fā)酵產(chǎn)品后期的貯藏[15]。

方式①水分散失慢，易滋生霉菌，方式②霉菌一直維持較高數(shù)量，黃曲霉毒素B1含量高于其他3個(gè)組。方式③益生菌不斷緩慢生長(zhǎng)，在貯藏15 d后，隨著發(fā)酵產(chǎn)品貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，益生菌生長(zhǎng)繁殖與死亡數(shù)量基本維持平衡，數(shù)量穩(wěn)定。益生菌長(zhǎng)期處于優(yōu)勢(shì)菌，抑制霉菌生長(zhǎng)，使得霉菌數(shù)量持續(xù)下降，菌渣中的霉菌毒素進(jìn)一步分解，含量進(jìn)一步下降。結(jié)果表明：黃曲霉毒素B1隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，濃度出現(xiàn)下降，且低于飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[16]。益生菌發(fā)酵不斷產(chǎn)熱，加上透氣，逐漸減少發(fā)酵產(chǎn)品中的水分，使得水分下降至7.69%，遠(yuǎn)低于國(guó)家飼料標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍。方式④是發(fā)酵食品常用的貯藏方式，該方式由于溫度低，可有效降低發(fā)酵品中的霉菌數(shù)量和黃曲霉毒素B1含量；但4℃同樣不利于益生菌的生長(zhǎng)繁殖，益生菌生長(zhǎng)繁殖數(shù)量低于死亡數(shù)量，導(dǎo)致益生菌活菌數(shù)量明顯下降，以唾液乳桿菌最為顯著，因此方式④不建議采用。

4 小結(jié)

本研究使用枯草芽孢桿菌和唾液乳桿菌對(duì)金針菇菌渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，改善了金針菇菌渣的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，提高了益生菌活菌數(shù)量，降低了霉菌數(shù)量和黃曲霉毒素B1含量，有效提高了消化酶活力，降低了金屬鈣的含量。采用室溫、透氣、避光對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行貯藏，可以有效維持益生菌活菌數(shù)量，30 d內(nèi)仍達(dá)到109CFU/g，超過(guò)國(guó)家發(fā)酵飼料標(biāo)準(zhǔn)。水分降至7.69%，可抑制霉菌生長(zhǎng)。霉菌含量和黃曲霉毒素含量均符合國(guó)家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求。