李文?竺芊惠?胡勇?宋帥杰?胡霞?張宇鋆?邱琳凌?王天康?蔣欣童

摘要：成團(tuán)泛菌（Pantoea vagans）是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，該菌廣泛地存在于自然界中。本研究在進(jìn)行櫻花根癌病致病菌的生防細(xì)菌篩選中，分離得到了一株對(duì)櫻花根癌病菌ACCC19197具有顯著拮抗作用的菌株，將其命名為L(zhǎng)WB35。通過(guò)抑菌圈試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌的平均抑菌圈可以達(dá)到2.1 cm。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)的結(jié)果，初步明確該菌屬于泛菌。利用PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA序列發(fā)現(xiàn)，該菌與成團(tuán)泛菌高度同源，進(jìn)一步鑒定該菌為成團(tuán)泛菌。該菌株的成功分離，為櫻花根癌病的生物防治提供了新的材料，也拓寬了我們對(duì)成團(tuán)泛菌的認(rèn)識(shí)。

關(guān)鍵詞：成團(tuán)泛菌;櫻花根癌病;根癌農(nóng)桿菌;生物防治

1.引言

成團(tuán)泛菌作為泛菌屬的模式菌，廣泛存在于環(huán)境中。該菌可作為內(nèi)生菌、腐生菌、病原菌及拮抗菌存在[1]。一些作為內(nèi)生菌的菌株，可以在植物內(nèi)部產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。一部分菌株還可以通過(guò)抑制其他真菌或者細(xì)菌的生長(zhǎng)，來(lái)預(yù)防因這些細(xì)菌引起的果實(shí)采后腐爛[2]。作為一種植物致病菌，它可以侵染多種植物，在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，包括水稻、玉米和核桃等[3-5]。對(duì)于成團(tuán)泛菌在生物防治中的作用，也有相關(guān)報(bào)道。研究表明，成團(tuán)泛菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對(duì)水稻病害有明顯的拮抗作用，對(duì)由細(xì)菌引起的火疫病也有較好的防治效果[6，7]。但是對(duì)于成團(tuán)泛菌對(duì)根癌農(nóng)桿菌的拮抗作用尚未有相關(guān)報(bào)道。

根癌農(nóng)桿菌是一種土壤中廣泛存在的革蘭氏陰性細(xì)菌，該菌寄主范圍廣，能侵染大多數(shù)雙子葉植物，造成植物的根部產(chǎn)生瘤狀突起，嚴(yán)重時(shí)影響植物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致植株死亡。對(duì)于根癌病的防治，因其是根部病害，往往在病害已經(jīng)很嚴(yán)重的時(shí)候才會(huì)得到養(yǎng)護(hù)人員的注意，因此，該病害的早期預(yù)防至關(guān)重要。生物防治就是這樣一種防治方法，能夠?qū)⒉『刂圃谇秩厩埃ㄟ^(guò)拮抗菌的拮抗作用，對(duì)致病菌株進(jìn)行防治，也是一種環(huán)保、高效的方法。對(duì)于根癌農(nóng)桿菌生防菌的研究，澳大利亞科學(xué)家Kerr分離的K84是目前生產(chǎn)上應(yīng)用較廣的菌株，該菌能夠產(chǎn)生核苷酸類細(xì)菌素，對(duì)根癌病的防治效果明顯[8]。

基于以上現(xiàn)狀，本研究希望能夠從土壤中分離得到對(duì)櫻花根癌病有較好防效的拮抗菌，以填補(bǔ)國(guó)內(nèi)生防菌種類的不足。通過(guò)相關(guān)試驗(yàn)，課題組成員從土壤中分離得到一株對(duì)櫻花致病根癌農(nóng)桿菌有著顯著拮抗作用的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)手段分析，該菌為成團(tuán)泛菌。研究結(jié)果為根癌病防治的微生物菌源提供了新的資源。

2.材料與方法

2.1 拮抗菌的分離及篩選

拮抗菌的分離及篩選主要采用梯度稀釋和抑菌圈試驗(yàn)兩種方法來(lái)進(jìn)行，通過(guò)觀察拮抗菌接種后產(chǎn)生的抑菌圈，來(lái)進(jìn)行拮抗菌的篩選。

2.2 拮抗菌的鑒定

形態(tài)學(xué)方面，利用透射電鏡進(jìn)行拍照觀察，生理生化指標(biāo)參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，分子生物學(xué)鑒定利用細(xì)菌的通用16S rRNA引物F8/R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析。

3.結(jié)果與分析

3.1 拮抗菌的分離

為了分離得到對(duì)櫻花致病根癌農(nóng)桿菌At2有拮抗作用的細(xì)菌，我們從土壤中進(jìn)行了土壤細(xì)菌的分離。通過(guò)抑菌圈試驗(yàn)，從2657株細(xì)菌中，分離獲得了一株對(duì)At2有顯著拮抗作用的細(xì)菌，該菌的抑菌圈平均直徑在共培養(yǎng)2天后達(dá)到了2.1 cm，將該菌命名為L(zhǎng)WB35（圖1a）

3.2 拮抗菌的鑒定

為了鑒定拮抗菌的種類，我們通過(guò)三個(gè)層面進(jìn)行綜合分析。在形態(tài)學(xué)方面，菌株LWB35在YEB培養(yǎng)基上產(chǎn)生圓形、光滑的菌落。革蘭氏染色為陰性。利用透射電鏡觀察，該菌為桿狀，具有周生鞭毛（圖1b）。該菌氧化酶陰性、接觸酶陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，可利用麥芽糖、蔗糖和木糖。根據(jù)該菌菌落特征和生理生化特點(diǎn)，初步判斷該菌為泛菌。PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA序列后分析發(fā)現(xiàn)，該菌與Pantoea vagans親緣關(guān)系最近。結(jié)合三種分析方法，將該菌歸為成團(tuán)泛菌。

4.討論

成團(tuán)泛菌作為一種植物致病菌，目前已有多篇相關(guān)報(bào)道。王大會(huì)等人從煙草細(xì)菌性葉枯病病葉中分離出了一株成團(tuán)泛菌菌株，該菌能夠引起煙葉中下部葉片腐爛，嚴(yán)重時(shí)病株率高達(dá)100%，對(duì)煙草的產(chǎn)量影響很大[9]。而作為一種拮抗菌，成團(tuán)泛菌對(duì)水稻引起的病害和火疫病有著較好的防效[6，7]。本研究從土壤中分離篩選出一株對(duì)櫻花根癌農(nóng)桿菌有明顯拮抗作用的成團(tuán)泛菌，是之前尚未報(bào)道的。本研究結(jié)果擴(kuò)寬了成團(tuán)泛菌拮抗作用的范圍，進(jìn)一步明確了成團(tuán)泛菌與根癌農(nóng)桿菌之間的互作。但是，該菌是如何對(duì)根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行拮抗作用的，他們的互作機(jī)理是什么，還需要進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] Brenner， Don J， Krieg， et al. Bergeys Manual? of Systematic Bacteriology[M]. Springer US， 2005.

[2] Trifi H， Salem I B， Benzina N K， et al. Effectiveness of the Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Pantoea sp. BRM17 in Enhancing Brassica napus Growth in Phosphogypsum-Amended Soil[J]. Pedosphere， 2017.

[3] 洪永聰，胡方平，黃曉南. 成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）對(duì)稻谷的致病性[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002（1）：32-36.

[4] 曹慧英. 玉米新病害—細(xì)菌干莖腐病的研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

[5] 李君，韓穎，趙寧，等. 云南31 個(gè)核桃品種對(duì)黑斑病的抗病性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2020，40（1）：67-71.

[6] Mukhopadhyay K， Garrison NK， Hinton DM， et al. Identification and characterization of bacterial endophytes of rice[J]. Mycopathologia， 1996， 134（3）：151-159.

[7] Pusey PL. Laboratory and field trials with selected microorganisms as biocontrol agents for fire blight[J]. VIII International Workshop on Fire Blight， 1999， 489（489）：655-662.

[8] Kerra A. Biological control of crown gall through production of Agrocin 84. Plant Disease，1980， 64（1）， 25-30.

[9]王大會(huì)，蔣承耿，王忠宇，等. 一種煙草細(xì)菌性葉枯病病原鑒定及防治藥劑篩選[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2021，42（3）：65-70.

致謝

本研究由寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018A610215）、浙江省2021年度高校國(guó)內(nèi)訪問(wèn)工程師“校企合作項(xiàng)目”（FG2021275）、2021年浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院項(xiàng)目（2021R462001）和浙江省教育廳科研項(xiàng)目資助（Y202044834）共同資助。