熊士領(lǐng), 洪歡歡,2, 聞路紅,2, 胡舜迪,2, 陳安琪,2, 熊 偉,2, 陳 臘,2*

(1. 寧波大學(xué)高等技術(shù)研究院, 浙江 寧波 315211; 2. 寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司, 浙江 寧波 315100)

《2020年中國(guó)毒情形勢(shì)報(bào)告》相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,目前國(guó)內(nèi)毒品濫用人數(shù)增速減緩但吸毒群體規(guī)模依然較大。吸毒人員篩查技術(shù)是毒品監(jiān)管和禁毒工作的重要支撐,為管控吸毒人員提供科學(xué)依據(jù)。自2011年《吸毒成癮認(rèn)定辦法》實(shí)施以來(lái),尿液中的毒品檢測(cè)是常用的吸毒人員現(xiàn)場(chǎng)快速篩查手段之一,其檢測(cè)結(jié)果也被認(rèn)為是吸毒成癮認(rèn)定的標(biāo)準(zhǔn)。相比于體外毒品,尿液中的毒品具有成分復(fù)雜、含量低、機(jī)體新陳代謝干擾大等特點(diǎn)[1],對(duì)高效的現(xiàn)場(chǎng)毒品分析技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的免疫膠體金分析法存在假陽(yáng)性和假陰性比例高、單次可檢測(cè)物質(zhì)種類少等缺點(diǎn)[2];光譜法技術(shù)在檢測(cè)混合物樣品時(shí),存在定量能力不足等問(wèn)題[3]。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜技術(shù)是目前常見(jiàn)生物樣本中毒品物質(zhì)分析與檢測(cè)手段的金標(biāo)準(zhǔn)方法,然而其對(duì)于單個(gè)樣品檢測(cè)前處理過(guò)程相對(duì)復(fù)雜[4],使用環(huán)境要求相對(duì)苛刻,耗時(shí)較長(zhǎng),不滿足一線的毒品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求。

近年來(lái),直接電離質(zhì)譜技術(shù)突飛猛進(jìn),如實(shí)時(shí)直接分析(DART)[5]、解吸電噴霧離子源(DESI)[6]、介質(zhì)阻擋放電(DBDI)[7,8]等,不需要樣品前處理或僅需簡(jiǎn)單的樣品前處理即可實(shí)現(xiàn)樣品原位分析,而且分析效率高,靈敏度高,已成功應(yīng)用于公共安全、食品安全、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域[9,10]。上述直接電離技術(shù)因需載氣工作,導(dǎo)致進(jìn)樣裝置相對(duì)復(fù)雜,從而限制了其在現(xiàn)場(chǎng)、便攜式方向的應(yīng)用。脈沖式電噴霧離子化技術(shù)[11],具有樣品需求量少、體積小、重量輕、無(wú)須載氣等特點(diǎn),已成功應(yīng)用于實(shí)際樣品中磺胺類物質(zhì)的篩查和分析[12];寧波華儀寧創(chuàng)智能科技公司在脈沖式電噴霧離子化技術(shù)的基礎(chǔ)上研制了探針式電噴霧離子源,并已成功應(yīng)用于毛發(fā)、污水等毒品檢測(cè)儀器中。

本工作基于探針式電噴霧離子源與便攜式質(zhì)譜儀聯(lián)用快檢平臺(tái),建立面向生物樣本的敞開(kāi)式直接電離質(zhì)譜技術(shù)的檢測(cè)方法,旨在滿足一線毒品檢測(cè)的檢測(cè)速度快、樣品種類多、準(zhǔn)確率高以及檢出限低等需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CRAIV-110便攜式質(zhì)譜儀、探針式離子源(寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司),探針噴頭(武漢微探生物科技有限公司); Vortex-5渦旋儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司); TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

純凈水(娃哈哈,杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);乙腈和乙酸乙酯(色譜純,美國(guó)TEDIA);磷酸氫二鈉、氫氧化鈉(國(guó)藥試劑);甲基苯丙胺(methamphetamine)、氯胺酮(ketamine)、可卡因(cocaine)、O6-單乙酰嗎啡(6-monoacetylmorphine)和3,4-亞甲雙氧甲基苯丙胺(MDMA)5種標(biāo)準(zhǔn)品溶液(質(zhì)量濃度100 μg/mL,公安部門(mén))。

空白尿液樣本的采集對(duì)象為云南省某市的5名健康男性,年齡區(qū)間在20～35歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備

使用乙腈溶液分別對(duì)100 μg/mL的5種毒品標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行稀釋,獲得50 ng/mL的5種單標(biāo)溶液。

分別取空白尿液300 μL,隨后加入精確量取的nμL 100 μg/mL5種毒品標(biāo)準(zhǔn)液至1.5 mL離心管中,加入(1000-n) μL乙腈,渦旋1 min后配制1、4、8、10、20、40、50、100、200、300、1 000 ng/mL等5種毒品的稀釋溶液,待測(cè)。

將50 mL 0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液與26.9 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液混合均勻,加純水稀釋至100 mL,配制成pH 12的緩沖鹽溶液。

1.2.2樣品前處理

取300 μL待測(cè)尿液樣品,加入300 μL pH 12的緩沖鹽溶液,靜置1 min,加入300 μL乙酸乙酯直接萃取,靜置1 min,之后渦旋30 s,離心1 min,最后用探針蘸取上層有機(jī)相約1 μL待測(cè)。

1.3 儀器條件

便攜式質(zhì)譜儀見(jiàn)圖1-Ⅰ。采樣毛細(xì)管:內(nèi)徑為0.37 mm,長(zhǎng)度為100 mm,直流電壓為90 V;線性離子阱:共振激發(fā)所用交流電的電壓為1～4 V,射頻(radio frequency, RF)幅值電壓為120～1 500 V, RF頻率為1.08 MHz;打拿極電壓:-5 500 V;倍增器電壓:-1 100 V;選擇標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行質(zhì)量掃描,掃描范圍為m/z50～700,儀器分辨率為1 Da;前級(jí)真空壓力:0.69 kPa。

圖 1 探針式電噴霧離子源-便攜式質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)Fig. 1 Setup of the probe type electrospray ion source and portable mass spectrometer system

探針式離子源見(jiàn)圖1-Ⅲ。離子源極性:正離子模式(ESI+);探針噴頭為石英玻璃毛細(xì)管:外徑為1.5 mm,內(nèi)徑為1.1 mm,長(zhǎng)度為5 cm;噴頭針尖口徑:50 μm;噴頭針尖到質(zhì)譜儀入口距離:10 mm。

MS2分析質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 各毒品的MS2分析參數(shù)Table 1 MS2 analysis parameters for each drug

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1噴霧電壓

為了使探針式電噴霧離子源-便攜式質(zhì)譜儀達(dá)到最佳的檢測(cè)狀態(tài),有必要提高離子化效率和提升離子的傳輸效率,因此需對(duì)探針式離子源的噴霧電壓和便攜式質(zhì)譜儀的毛細(xì)管溫度進(jìn)行優(yōu)化。由于敞開(kāi)式離子源信號(hào)難免受到各種因素干擾,導(dǎo)致質(zhì)譜信號(hào)波動(dòng),因此本工作采用計(jì)算平均峰強(qiáng)的方法來(lái)減小信號(hào)波動(dòng)所帶來(lái)的誤差,離子強(qiáng)度信號(hào)的波動(dòng)可用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來(lái)表征。

使用50 ng/mL的可卡因乙腈溶液作為測(cè)試樣品,待檢測(cè)前用等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取,蘸取上層有機(jī)相直接分析,并以二級(jí)質(zhì)譜分析模式下可卡因的子離子(m/z182)強(qiáng)度作為考察指標(biāo),其中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)采樣5次,且每次更換不同探針。該強(qiáng)度取值方式為:在整個(gè)采樣時(shí)間內(nèi),當(dāng)5 s后某一時(shí)刻的離子強(qiáng)度下降到最初5 s時(shí)間內(nèi)離子強(qiáng)度平均值的1/2時(shí),則將該段時(shí)間內(nèi)的離子強(qiáng)度的平均值作為有效強(qiáng)度。在0.3～4.8 kV噴霧電壓范圍內(nèi),考察了探針式電噴霧離子源的噴霧電壓對(duì)離子信號(hào)強(qiáng)度和噴霧時(shí)間的影響。由圖2a可以看出,隨著噴霧電壓從0.3 kV升高至1.3 kV,信號(hào)強(qiáng)度從零開(kāi)始陡升,這是因?yàn)槭┘拥膰婌F電壓在1.3 kV時(shí),達(dá)到液體表面產(chǎn)生電荷分離所需的電場(chǎng)的閾值電壓[13]。在1.3～3.3 kV時(shí)隨著噴霧電壓的增加,信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)小幅度的先下降后上升,這是因?yàn)殡S著電壓的不斷增大噴霧頻率開(kāi)始加大,產(chǎn)生的噴霧液滴出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)[14];在電壓超過(guò)3.3 kV之后,噴霧頻率增加且噴霧液滴變大,去溶劑化效果變差[15,16],從而導(dǎo)致離子在質(zhì)譜儀內(nèi)傳輸時(shí)損失增加。相比在1.3～3.3 kV噴霧電壓下的各信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度,噴霧電壓為1.8 kV時(shí),信號(hào)強(qiáng)度波動(dòng)較小。

圖 2 (a)相對(duì)離子強(qiáng)度和(b)相對(duì)噴霧時(shí)間與噴霧電壓關(guān)系,(c)噴霧電壓為1.8 kV時(shí)離子強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線, (d)相對(duì)離子強(qiáng)度與傳輸毛細(xì)管溫度的關(guān)系(n=5)Fig. 2 (a) Relative ion intensities and (b) relative spray time versus spray voltage, (c) ion intensity over time at a spray voltage of 1.8 kV, and (d) relationship between relative ion intensities and transport capillary temperatures (n=5)

如圖2b所示,隨著噴霧電壓的不斷增大,產(chǎn)生噴霧的持續(xù)時(shí)間(計(jì)算離子有效強(qiáng)度時(shí)其對(duì)應(yīng)的時(shí)長(zhǎng))與其呈負(fù)相關(guān),因?yàn)樵谔结槂?nèi)溶液量一定的情況下,噴霧電壓越大噴霧的速度就越快,噴霧持續(xù)時(shí)間就越短。當(dāng)噴霧電壓在1.3 kV以下時(shí),無(wú)法產(chǎn)生噴霧,因此圖2b不包含該范圍內(nèi)數(shù)據(jù)。

當(dāng)噴霧電壓設(shè)為1.8 kV時(shí),離子峰強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線如圖2c所示,可以看到離子峰強(qiáng)度在前45 s內(nèi)相對(duì)比較穩(wěn)定,RSD<10%,隨后信號(hào)強(qiáng)度逐漸下降?？紤]到信號(hào)穩(wěn)定性和噴霧時(shí)長(zhǎng)對(duì)數(shù)據(jù)分析的影響,除特殊說(shuō)明外,本工作后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)的噴霧電壓均設(shè)置為1.8 kV,所有離子峰強(qiáng)度檢測(cè)均采用噴霧前20 s內(nèi)的有效強(qiáng)度數(shù)據(jù)計(jì)算平均值。

2.1.2進(jìn)樣口溫度

由于便攜式質(zhì)譜儀的傳輸毛細(xì)管溫度會(huì)對(duì)離子源噴霧液滴的脫溶劑化及毛細(xì)管內(nèi)帶動(dòng)離子傳輸?shù)臍饬鳡顟B(tài)產(chǎn)生影響[17],因此考察了不同毛細(xì)管溫度對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的影響。同樣以50 ng/mL的可卡因溶液做測(cè)試,其子離子(m/z182)強(qiáng)度作為考察目標(biāo),其中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)采樣5次,且每次更換不同探針,其離子信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度與溫度的關(guān)系如圖2d所示。當(dāng)質(zhì)譜毛細(xì)管溫度在85～145 ℃范圍內(nèi)時(shí),信號(hào)強(qiáng)度隨著溫度的提高而增大,這是因?yàn)殡S著溫度的升高傳輸毛細(xì)管內(nèi)的氣流從湍流變成了層流[18],離子因撞擊到毛細(xì)管內(nèi)壁上而造成的損失大大降低。當(dāng)溫度在145～245 ℃范圍內(nèi),信號(hào)強(qiáng)度的曲線波動(dòng)較小且呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢(shì),說(shuō)明提高溫度有利于提升脫溶劑化效果,離子在質(zhì)譜內(nèi)的傳輸效率得到提高。這是因?yàn)樾盘?hào)強(qiáng)度的提升超過(guò)了因溫度升高擴(kuò)散作用增強(qiáng)而帶來(lái)的損失。當(dāng)溫度為185～205 ℃時(shí),信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定且差異性不大,其中溫度為205 ℃時(shí),RSD相對(duì)較小;綜合權(quán)衡了質(zhì)譜毛細(xì)管加熱裝置的壽命和密封圈的耐熱性后,本工作后續(xù)實(shí)驗(yàn)將質(zhì)譜毛細(xì)管溫度設(shè)為205 ℃。

綜上,將探針式電噴霧離子源的噴霧電壓設(shè)置為1.8 kV,便攜式質(zhì)譜儀的毛細(xì)管溫度設(shè)置為205 ℃。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)

使用50 ng/mL的甲基苯丙胺、氯胺酮、可卡因、O6-單乙酰嗎啡和MDMA 5種單標(biāo)溶液,在檢測(cè)前用等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取,使用探針蘸取上層有機(jī)相直接分析,采用正離子質(zhì)譜模式,并同時(shí)記錄MS1和MS2質(zhì)譜數(shù)據(jù),結(jié)果如圖3所示?？梢钥吹教结樖诫妵婌F離子源結(jié)合便攜式質(zhì)譜儀不僅能夠準(zhǔn)確定性目標(biāo)樣品,而且檢測(cè)出的二級(jí)子離子也具有較高的信噪比。

圖 3 5種常見(jiàn)毒品標(biāo)準(zhǔn)溶液的MS1和MS2譜圖Fig. 3 MS1 and MS2 spectra of the five common drug standard solutions

2.3 線性范圍、檢出限和回收率

在前述儀器優(yōu)化后的條件下,通過(guò)對(duì)1.2.1節(jié)中獲得的1、4、8、10、20、40、50、100 ng/mL的5種毒品稀釋溶液采用1.2.2節(jié)方法進(jìn)行前處理,每種毒品的每個(gè)加標(biāo)溶液進(jìn)行5次檢測(cè)且每次更換不同探針,其在各自的線性范圍內(nèi)響應(yīng)關(guān)系如表2所示。從表2中可以看到,尿液基質(zhì)加標(biāo)的5種毒品質(zhì)譜信號(hào)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,甲基苯丙胺、氯胺酮、MDMA、可卡因毒品的子離子信號(hào)強(qiáng)度和質(zhì)量濃度之間的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,線性關(guān)系良好,說(shuō)明該尿液前處理方法與聯(lián)用檢測(cè)平臺(tái)結(jié)合使用具有優(yōu)良的檢出能力。

表 2 尿液基質(zhì)中5種常見(jiàn)毒品的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (R2), and RSDs of the five common drugs in urine matrix (n=5)

為了驗(yàn)證1.2.2節(jié)前處理方法的有效性,使用探針式電噴霧離子源聯(lián)用便攜式質(zhì)譜儀檢測(cè)平臺(tái)分別對(duì)空白尿液樣本進(jìn)行了常規(guī)5種毒品不同水平的加標(biāo)回收測(cè)試?？瞻啄蛞褐懈魑镔|(zhì)的加標(biāo)水平分別為10、50、100 ng/mL,各加標(biāo)樣品均進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn),采用定量子離子強(qiáng)度計(jì)算回收率和RSD,結(jié)果見(jiàn)表3,可以看出在3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率為 56.1%～103.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.0%～27.8%。以信噪比(S/N)大于或等于3作為判斷是否檢出的依據(jù),5種毒品的檢出限(LOD)為0.5～30 ng/mL,這表明儀器系統(tǒng)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性,對(duì)尿液中毒品檢測(cè)具有較好的適用性。

表 3 5種毒品在尿液中的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限Table 3 Recoveries, RSDs, and limits of detection (LODs) of the five drugs spiked in urine samples

2.4 實(shí)際尿液樣本測(cè)試

針對(duì)云南某地社區(qū)戒毒康復(fù)中心提供的一批實(shí)際尿液樣本(已進(jìn)行過(guò)司法鑒定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)),利用本工作建立的方法進(jìn)行復(fù)檢,進(jìn)一步驗(yàn)證其在實(shí)際樣品檢測(cè)中的適用性。檢測(cè)樣本中同時(shí)吸食甲基苯丙胺(俗稱冰毒)與嗎啡的樣本數(shù)為5例,吸食冰毒的樣本數(shù)為10例,吸食嗎啡的樣本數(shù)為25例,陰性樣本數(shù)為110例。

采用聯(lián)用檢測(cè)平臺(tái)完成所有樣本的檢測(cè)耗時(shí)為55 min,無(wú)論對(duì)單個(gè)樣本中的一種毒品還是多種毒品的檢測(cè)耗時(shí)均不超過(guò)20 s。檢測(cè)結(jié)果表明,5例多組分混檢(multi-component detection)的樣本(其中含有冰毒和嗎啡兩種毒品)均能夠在所開(kāi)發(fā)的尿液前處理方法下使用聯(lián)用檢測(cè)平臺(tái)準(zhǔn)確檢出,僅1例嗎啡的陽(yáng)性樣本未檢出,其他樣本檢測(cè)結(jié)果均與司法鑒定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果一致,整體的檢測(cè)準(zhǔn)確率超過(guò)99%。嗎啡樣本檢測(cè)結(jié)果之所以存在未檢出的現(xiàn)象,這可能是因?yàn)樵撐镔|(zhì)在人體內(nèi)與葡萄糖醛酸容易結(jié)合形成嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷等其他物質(zhì)[19],影響到該目標(biāo)物的檢測(cè)。

總體而言,利用聯(lián)用檢測(cè)平臺(tái)結(jié)合所建立的尿液前處理方法,不僅檢測(cè)所需時(shí)間短而且能對(duì)樣本目標(biāo)物進(jìn)行混檢,能夠適用于實(shí)際尿液樣本的檢測(cè)并具有較高的準(zhǔn)確率,其對(duì)甲基苯丙胺的檢出限接近司法鑒定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[20],且所有常規(guī)毒品檢出限都遠(yuǎn)低于膠體金行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(GA/T 1666-2019, YY/T 1595-2017, GA/T 1668-2019, GA/T 1692-2020)。

3 結(jié)論

本工作基于探針式電噴霧離子源與便攜式質(zhì)譜儀聯(lián)用檢測(cè)平臺(tái),考察了探針式電噴霧離子源的噴霧電壓與質(zhì)譜儀毛細(xì)管入口溫度對(duì)儀器性能的影響,開(kāi)發(fā)了一套用于尿液生物檢材的前處理技術(shù),驗(yàn)證了該聯(lián)用檢測(cè)平臺(tái)結(jié)合前處理方法的檢測(cè)靈敏度、適用性、定性能力以及對(duì)實(shí)際樣本的檢測(cè)水平和準(zhǔn)確性。結(jié)果表明該方法具有檢出限低、操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),解決了傳統(tǒng)快篩技術(shù)存在假陽(yáng)率高、定量能力不足的問(wèn)題,并針對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜技術(shù)在快速檢測(cè)中存在的前處理復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、使用環(huán)境苛刻等問(wèn)題給出了有效替代方案,可進(jìn)一步拓寬敞開(kāi)式直接電離質(zhì)譜技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用,并可作為現(xiàn)場(chǎng)吸毒人員快速篩查的有力“武器”,提升一線實(shí)戰(zhàn)水平,為健康中國(guó)、平安中國(guó)建設(shè)做出貢獻(xiàn)。