吳奇翰

(福建師范大學(xué)附屬中學(xué)，福建 福州 350007)

銀杏(GinkgobilobaL.)具有較高觀賞、食用等價(jià)值，其在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生多種特有的次生代謝化合物，如銀杏黃酮(可預(yù)防口腔潰瘍復(fù)發(fā)[1]、抑制肺癌細(xì)胞活性[2])、銀杏內(nèi)酯(可治療血管性癡呆和調(diào)節(jié)血脂[3])等。但上述次生代謝物一般從葉片中取得，隨著對(duì)其利用價(jià)值的研究和開發(fā)，傳統(tǒng)栽植方法周期長(zhǎng)、成本高、受環(huán)境影響大的弊端逐漸顯現(xiàn)，無法很好滿足市場(chǎng)需求。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，可直接從愈傷組織中生產(chǎn)有益次生代謝物，實(shí)現(xiàn)次生代謝物的工業(yè)化生產(chǎn)[4]；還可快速、規(guī)模化繁育銀杏植株，具有一定研究意義與應(yīng)用前景。

但銀杏的組織培養(yǎng)面臨許多難點(diǎn)，如：植株生長(zhǎng)速度較慢，組織細(xì)胞分裂活力較弱，外植體誘導(dǎo)分化難度大；受真菌和細(xì)菌感染，污染較嚴(yán)重，對(duì)取材和消毒環(huán)節(jié)要求嚴(yán)格；代謝途徑復(fù)雜，富含酚類物質(zhì)，培養(yǎng)過程中易氧化生成醌，醌在培養(yǎng)基中擴(kuò)散，影響組織代謝，進(jìn)而導(dǎo)致褐化，故對(duì)培養(yǎng)條件十分敏感。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已將不同外植體材料誘導(dǎo)脫分化形成愈傷組織，并進(jìn)一步誘導(dǎo)其分化出不定芽、不定根，最終形成植株；或?qū)τ鷤M織進(jìn)行繼代擴(kuò)大培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，提取次生代謝物。但目前仍面臨嚴(yán)重的污染和褐化問題；且次生代謝物含量低于天然葉片水平[5-6]，不利于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。為提高成功率、提升產(chǎn)量的優(yōu)化探究正不斷進(jìn)行。

本文以步驟為序，綜述了現(xiàn)有研究在組織培養(yǎng)各環(huán)節(jié)中提出的改進(jìn)方案，歸納了外植體的最佳取材時(shí)間、部位與其保存方法，探討了消毒劑的種類、濃度和使用時(shí)間，提出了培養(yǎng)基pH、溫度的適宜條件，整理了不同學(xué)者的培養(yǎng)基配方和提出的一些益于培養(yǎng)的化合物添加，以供進(jìn)一步研究參考。同時(shí)，本文比較分析了不同學(xué)者對(duì)污染和褐化2個(gè)問題進(jìn)行改良設(shè)計(jì)中的不同觀點(diǎn)，初步討論了相關(guān)原理，提出了較為適宜的培養(yǎng)方案，并指出了今后的研究重點(diǎn)和方向。

1 外植體取材與保存環(huán)節(jié)的優(yōu)化

目前，研究主要以胚(包括幼胚、成熟胚、胚乳、子葉)和莖(包括莖段和莖尖)2種外植體為材料，葉片作為外植體材料成功率較低[7-8]，葉柄誘導(dǎo)愈傷組織難度較大[9]。

胚外植體在不同時(shí)期都具有較高誘導(dǎo)潛能[10]，而3月下旬至5月中旬抽出的當(dāng)年生枝條具有最高的誘變潛力[11-13]；莖段外植體莖尖和下段部分的誘導(dǎo)率較低，而上段、中段誘導(dǎo)效果較好，具有一定的位置效應(yīng)[14]；10 a以下的銀杏植株作為材料來源，細(xì)胞分裂較旺盛，誘導(dǎo)難度較低。另外，若把形成愈傷組織作為試驗(yàn)?zāi)康?，母株年齡對(duì)誘導(dǎo)率的影響較不顯著；但若把獲取次生代謝物作為目的，則應(yīng)該選擇2—6年生的幼齡銀杏植株作為外植體來源[15]。

胚外植體在采集后不經(jīng)腐熟直接去除外種皮，用自來水沖洗干凈后，可放入冰箱中2—4 ℃儲(chǔ)存[16-17]；也可將其與沙子混合后埋入土中沙藏[11]，還可用KMnO4消毒后常溫貯存[10]。其中，低溫保存是目前較為主流的保存方法。對(duì)于莖段外植體，可用抗氧化劑溶液[含150 mg/L CA(枸櫞酸)和100 mg/L Vc(抗壞血酸)]保存[18]，也有研究用16 h的4 ℃低溫保存[19]。上述處理有利于殺滅部分外植體所帶雜菌以減輕污染，但同樣面臨組織活力降低的問題。目前絕大研究采用隨采隨用的方式，以減少在保存過程中造成污染的可能，同時(shí)避免活力降低。

綜上所述，在選擇外植體時(shí)，應(yīng)選擇細(xì)胞生長(zhǎng)分裂旺盛的部位，其分化潛能更強(qiáng)，誘導(dǎo)難度更低。同時(shí)外植體不能太嫩，也不能木質(zhì)化程度太高。太嫩的組織細(xì)胞雖細(xì)胞分裂較旺盛，但在消毒時(shí)藥品滲透也較快，在后續(xù)的漂洗操作中不易清除，細(xì)胞易失活甚至破裂，造成的褐變現(xiàn)象較嚴(yán)重；而木質(zhì)化程度較高的部位細(xì)胞分化困難，同時(shí)對(duì)外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收不利，也會(huì)降低組織培養(yǎng)的效能。同時(shí)，從外植體種類上來看，胚外植體與莖外植體在誘導(dǎo)愈傷組織的成功率和形成效果等方面均優(yōu)于葉外植體。由于不必在特定時(shí)段隨采隨用，且種皮的保護(hù)使得消毒較易取得良好效果，胚外植體是最好的外植體選擇。

2 消毒與接種環(huán)節(jié)的優(yōu)化

莖段和葉片外植體采集后應(yīng)在洗衣粉中浸泡30—60 min[15, 20]，后轉(zhuǎn)用自來水清洗5 min，蒸餾水漂洗2—5次，每次1—2 min；也有研究指出可省略洗衣粉浸泡的步驟，并相應(yīng)延長(zhǎng)自來水清洗時(shí)間到30 min[15]，而后應(yīng)立即進(jìn)行消毒，以最大程度減輕和避免污染。胚外植體保存后，先去除骨質(zhì)外種皮，再經(jīng)消毒進(jìn)入培養(yǎng)。在研究中，消毒劑的種類、濃度和使用時(shí)間對(duì)污染率和褐化率均有直接且重要的影響。有研究采用70% 乙醇30 s結(jié)合0.1% 升汞(氯化汞)溶液8—10 min消毒[7-8]，也有研究將消毒的時(shí)間加倍處理(60 s乙醇、20 min 氯化汞)[15]。其中，乙醇消毒時(shí)間的影響不顯著，而升汞消毒時(shí)間則有顯著影響：時(shí)間過長(zhǎng)，高毒性的汞離子不易清除完全，易導(dǎo)致褐化甚至死亡；時(shí)間太短，則面臨滅菌不完全，污染率高的問題。對(duì)于莖段外植體[11]和胚外植體[21]，升汞最佳使用時(shí)間為6 min；而對(duì)于葉片外植體適宜消毒時(shí)間為2—4 min[22, 15]。

由于升汞的高毒性不利于試驗(yàn)安全操作，近年來已報(bào)道了其他消毒劑的研究與探索。目前應(yīng)用較為廣泛的消毒劑主要有新潔爾滅、雙氧水和漂白粉溶液等，也有使用1.0 mg/L鏈霉素溶液進(jìn)行消毒的報(bào)道[23]。用70% 酒精初步消毒90 s后，轉(zhuǎn)用0.5% 新潔爾滅處理15 min可以取得良好效果，但同樣的是新潔爾滅濃度不宜過高，時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以免組織褐化；用12% 雙氧水處理銀杏幼莖外植體8—10 min也可以取得良好效果[24]。

對(duì)于較易消毒的胚外植體，有使用10% 漂白粉溶液消毒15 min的報(bào)道[10, 25-27]，也有用漂白粉溶液結(jié)合短時(shí)酒精消毒的案例，如70%酒精消毒1 min后轉(zhuǎn)用2%[28]或3%[29]漂白粉溶液消毒15 min。但對(duì)于較難消毒的外植體，大多需要將其與其他消毒劑結(jié)合使用，如初步消毒后轉(zhuǎn)用升汞5 min[30]處理；也可提高溶液濃度并延長(zhǎng)使用時(shí)間，如姜蓓等應(yīng)用17%溶液消毒20 min[31]；Bekhit等應(yīng)用25% 溶液消毒20 min[32]；也有研究加入1—2滴吐溫20[33]或吐溫80[34]以增強(qiáng)消毒效果。

綜上所述，消毒劑的濃度越高，使用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)組織的作用越充分，感染率越低；但同時(shí)漂洗清除完全的難度也越大，殘留的有害物質(zhì)越多，褐化現(xiàn)象越易發(fā)生。目前研究廣泛認(rèn)可的最佳消毒劑的使用方案為0.1% 升汞溶液消毒8 min。實(shí)際試驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)外植體種類、微生物感染程度、消毒劑浸潤(rùn)的難易程度，選擇合適的消毒濃度和消毒時(shí)間。通常情況下，較幼嫩的外植體對(duì)消毒劑的耐受性較弱，同時(shí)帶有的微生物也較少，故使用時(shí)間也可相應(yīng)縮短。應(yīng)用其他消毒劑可提高試驗(yàn)安全性，故是目前和未來優(yōu)化探究的方向之一。目前，漂白粉的消毒效果較為有限，但與其他方法結(jié)合使用或也可在提高安全性、降低成本的同時(shí)得到較好的效果。

消毒劑消毒后，應(yīng)用無菌水漂洗外植體3—5次[5]，以減少消毒劑對(duì)組織的毒害，后立即接種到培養(yǎng)基上。根據(jù)褐化成因，應(yīng)盡量減少外植體與培養(yǎng)基的接觸面積，以減緩有害物質(zhì)擴(kuò)散。葉片外植體接種時(shí)應(yīng)注意切口平齊，大小適中。其與培養(yǎng)基接觸面積相對(duì)較大，可能是褐化率較高的原因之一；莖段接種時(shí)應(yīng)將其剪成小段，豎直接種在培養(yǎng)基上。有研究指出，剪切后的外植體長(zhǎng)度越長(zhǎng)，褐化率越低[20]。綜合考慮褐化率和外植體材料的利用率，剪切后外植體的最佳長(zhǎng)度為2 cm左右。

3 培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

目前，銀杏組織培養(yǎng)主要目的有二，一是形成完整植株，二是提取次生代謝物。但不論目的如何，多數(shù)研究都需先誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織。愈傷組織形成后，可以在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出不定芽、不定根，形成試管苗，后續(xù)通過煉苗等獲得完整植株；或?qū)ζ溥M(jìn)行繼代擴(kuò)大培養(yǎng)，將其轉(zhuǎn)入到細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，以提取有益次生代謝物。由于細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝物的積累并不成平行關(guān)系，應(yīng)分別考慮。

3.1 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基

目前對(duì)于銀杏愈傷組織誘導(dǎo)的研究已較為完善，部分配方整理如表1。

表1 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基配方

基本培養(yǎng)基作為大量元素和微量元素的提供者，是影響分化率和次生代謝物產(chǎn)量的最顯著因素[10, 50]。木本植物組織培養(yǎng)所常用的低鹽DCR培養(yǎng)基并不有利于銀杏愈傷組織的誘導(dǎo)[10, 12]，B5, N6, White培養(yǎng)基也均不是銀杏組織培養(yǎng)的較好選擇[15]。大多數(shù)研究認(rèn)為，MS培養(yǎng)基可以良好地誘導(dǎo)愈傷組織。也有不少研究指出改良MS培養(yǎng)基(1/2 MS和1/4 MS)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)更加有益，但由于效果差異不大，研究仍將MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基的主要選擇。

綜合上述研究，較高N, K元素含量，特別是高銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的基本培養(yǎng)基對(duì)于銀杏愈傷組織的誘導(dǎo)有利，說明銀杏需要較多的大量元素以滿足原生代謝產(chǎn)物的生成，促進(jìn)形成愈傷組織。

對(duì)于微量元素，陳雷等指出1.250 mg/L Na2MoO4·2H2O, 24.800 mg/L H3BO3, 22.300 mg/L MnSO4·4H2O, 0.500 mg/L CuSO4·5H2O, 0.125 mg/L CoCl2·6H2O是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳含量。含量過低，不利于愈傷組織生長(zhǎng)，而在一定程度上提高含量，可抑制組織褐變，且對(duì)無機(jī)鹽總含量和滲透壓影響不大[47]，但含量過高，對(duì)組織也有一定毒害作用。

也有對(duì)瓊脂(默認(rèn)質(zhì)量濃度7 g/L)進(jìn)行改進(jìn)的研究。一些試驗(yàn)表明，在默認(rèn)的瓊脂濃度下，培養(yǎng)基固化不足，不利于外植體保持豎直，其最終與培養(yǎng)基的接觸面積增大，更易褐化和污染；將瓊脂含量增加1—2 g/L可在較少影響物質(zhì)吸收的前提下減少褐化發(fā)生，更利于接種和幼苗的生長(zhǎng)[20]。

對(duì)于糖類添加量，一方面有研究發(fā)現(xiàn)不添加蔗糖可同時(shí)減少褐化與污染[20]。但另一方面，也有研究指出增加蔗糖含量到4%[9]或5%[54]更有利于培養(yǎng)，并認(rèn)為高糖造成的較高滲透壓可減少褐化、促進(jìn)愈傷組織發(fā)育[21]。關(guān)于糖類物質(zhì)對(duì)銀杏組織培養(yǎng)的影響還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明和在理論上支持。

試驗(yàn)已證明，未添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)形成愈傷組織[36]。這說明外植體自身生理狀況和內(nèi)源激素?zé)o法支持愈傷組織形成，需要外源激素的適當(dāng)添加。對(duì)于細(xì)胞分裂素，NAA(1-萘乙酸)為較好選擇，常用的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)并不能較好適用于銀杏，反對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有一定抑制作用[53]。相較而言，NAA誘導(dǎo)出的愈傷組織雖在前期生長(zhǎng)較慢，但后期褐化率低[54]，生長(zhǎng)活力充足[50]；對(duì)于生長(zhǎng)素，6-BA, KT(6-呋喃氨基嘌呤)與NAA相結(jié)合使用是較好選擇，ZT(玉米素)[55]和IBA[15]的誘導(dǎo)效果不佳。綜合考慮，目前研究多使用NAA和KT組合誘導(dǎo)愈傷組織。也有研究指出，NAA與6-BA組合可使愈傷組織生長(zhǎng)得更良好且后期更少出現(xiàn)褐化[20]，并認(rèn)為這與KT生理活性過低導(dǎo)致后期細(xì)胞分裂素不足有一定關(guān)系[8]?？傮w而言，由于銀杏天然植株生長(zhǎng)速度較慢，外植體對(duì)具有較高活性(如2,4-D)或較高濃度的植物激素均不能良好適應(yīng)，導(dǎo)致代謝途徑紊亂，褐化率提高，次生代謝物合成減少。為此，絕大多數(shù)研究使用濃度較低、生理活性較低的植物激素組合進(jìn)行培養(yǎng)。

對(duì)于培養(yǎng)基中其他物質(zhì)的添加，有研究稱500 mg/L Gln(谷氨酰胺)[10]有助于增加誘導(dǎo)成功率；100 mg/L殼聚糖有利于愈傷組織的分化，但需要光照條件的配合才有顯著差異[5]。同時(shí)，AgNO3可以作為乙烯抑制劑，影響內(nèi)源激素的合成以增加誘導(dǎo)率，但若濃度過高，Ag+競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合葉綠素分子[17]，也可能導(dǎo)致愈傷組織重金屬中毒。故AgNO3使用時(shí)的最佳濃度為1 mg/L[16]。

3.2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基

對(duì)于銀杏的組織培養(yǎng)，目前器官發(fā)生途徑有2種。一種是間接器官發(fā)生，即先誘導(dǎo)出愈傷組織，再誘導(dǎo)形成不定芽、不定根，多見于子葉外植體、胚乳外植體和葉片外植體；另一種是直接器官發(fā)生，即不經(jīng)過愈傷組織直接形成器官，多見于胚外植體和莖段外植體(帶腋芽)。在多數(shù)研究中，外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后不需轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)即可誘導(dǎo)其產(chǎn)生不定芽和不定根，針對(duì)分化的培養(yǎng)基配方優(yōu)化與改進(jìn)較少。部分培養(yǎng)基配方整理如表2。

表2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配方

3.3 繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基

對(duì)誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，有利于擴(kuò)充試驗(yàn)材料，也有利于產(chǎn)生更多的次生代謝物，為工業(yè)化提取應(yīng)用建立條件。部分繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方整理如表3。

表3 繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基配方

有不少研究針對(duì)繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基做出了改進(jìn)，如提出葡萄糖的利用雖較蔗糖不利于誘導(dǎo)，但后期黃酮產(chǎn)量較高[53]；0.002‰的10 nm直徑磁鐵礦納米顆粒可以在提高抗氧化水平的同時(shí)增加次生代謝物產(chǎn)量[33]；0.5 mmol/L硝酸鈰有利于增加黃酮和內(nèi)酯的產(chǎn)量；水楊酸(SA)可促進(jìn)次生代謝物的產(chǎn)生和釋放[29]。

3.4 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基

針對(duì)提取次生代謝物的研究可在多次繼代后將生長(zhǎng)良好的愈傷組織剪碎，按30—40 g/L[57]接種在液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)液的體積為搖瓶的1/3—1/2，在旋轉(zhuǎn)式搖床上以110—120 r/min[57-58]速度懸浮培養(yǎng)，在20 d時(shí)收獲細(xì)胞[15]。部分配方整理如表4。

表4 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基配方

與愈傷組織相比，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞由于與培養(yǎng)基的結(jié)合更加充分，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收更加容易，但也對(duì)環(huán)境更為敏感，培養(yǎng)基中成分的差異往往會(huì)產(chǎn)生很大的影響。同時(shí)，在固體培養(yǎng)基中適宜的激素濃度配比不一定適于液體懸浮培養(yǎng)。不過，也有研究直接將愈傷組織培養(yǎng)基配方去除瓊脂后作為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基[38]。

研究指出，MS和B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基對(duì)銀杏細(xì)胞進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)較佳。若以生產(chǎn)黃酮為主B5培養(yǎng)基較佳，若以生產(chǎn)內(nèi)酯為主則MS培養(yǎng)基較佳[16]。同時(shí)，去除培養(yǎng)基中的氮源，雖然不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，但有利于提高次生代謝物產(chǎn)量[57]。而對(duì)于碳源，蔗糖最適于次生代謝物的積累，葡萄糖則最適于細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一定范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)高蔗糖濃度有利于組織培養(yǎng)，但過高的蔗糖易影響滲透壓，降低組織培養(yǎng)效能[38]。30 g/L蔗糖與15 g/L的葡萄糖混合添加是最佳的碳源配方[16]。

此外，1×10-7mol/L TDZ(苯基噻二唑基脲)可同時(shí)發(fā)揮細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的功能，保持懸浮細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，增加次生代謝物的積累[48]；0.05%的蘆薈汁添加有益于次生代謝物的合成[61]；0.10 g/L的瓊脂糖有利于黃酮的累積[57]；5 mL/L蜂蜜的添加也有利于黃酮的積累；培養(yǎng)第9 d時(shí)添加2×10-5的茉莉酸甲酯(MJ)有利于提高黃酮產(chǎn)量；但CH(水解酪蛋白)在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中并不能提高效能[35]。

3.5 對(duì)抗褐變的配方優(yōu)化

由于含有較多的單寧和酚類物質(zhì)，銀杏組織培養(yǎng)全過程中均較易出現(xiàn)褐化問題。針對(duì)這一問題，研究已探討了多種抗褐化劑的應(yīng)用。王義強(qiáng)提出最佳抗氧化劑為10 mg/L Vc，其次為1 g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)[44]；單超得出2 g/L AC有利于外植體狀態(tài)保持良好[11]，且效果明顯較其他抗褐化劑好[21]；胡蕙露等證實(shí)AC可有效防止褐變，并指出AC含量對(duì)培養(yǎng)影響達(dá)到極顯著水平，甚至超過植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[30]，且對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)是必需的[36]。

CA(檸檬酸), PA(植酸), 硫代硫酸鈉和EDTA二鈉有助于抑制PPO(多酚氧化酶)活性[62]。Vc作為維生素，是一種較為安全的抗氧化劑，能夠促進(jìn)醌重新還原為酚類物質(zhì)，抑制醌的二次聚合反應(yīng)，同時(shí)可使培養(yǎng)環(huán)境更趨于堿性，抑制PPO(多酚氧化酶)的活性以減少褐變[63]；AC主要是吸附培養(yǎng)基中對(duì)組織產(chǎn)生毒害的物質(zhì)，提供的暗環(huán)境也有利于激素(特別是光敏性的IBA和IAA[64])的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生理活性。但由于AC對(duì)酚類物質(zhì)和植物激素均具較高親和性[65]，可能會(huì)不加選擇地吸附培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素[66]，對(duì)組織培養(yǎng)產(chǎn)生不利影響[67]，故應(yīng)用時(shí)或需增加激素含量以降低影響；PVP作為一種吸附劑，雖具有選擇性吸附能力，但其吸附有害物質(zhì)，特別是醌類物質(zhì)的能力較弱，在應(yīng)用中效果也較差。

然而，也有不少研究指出無論哪種抗褐化劑對(duì)減少褐化的作用均不顯著。江靜等指出PVP, Vc, AC的抗褐變效應(yīng)并不突出[22]；喻娜等也認(rèn)為L(zhǎng)-半胱氨酸和腺苷-5′-三磷酸二鈉鹽并不能產(chǎn)生良好效果[37]?？赡苡捎赑A的酸性會(huì)使愈傷組織生化反應(yīng)不協(xié)調(diào)，且酸性條件下PPO酶活性較高，非但未能達(dá)到抑制褐化的功效[56]，反而可能加劇褐化[25]。

4 外環(huán)境條件的優(yōu)化

按照傳統(tǒng)慣例，愈傷組織的分化應(yīng)在暗條件下進(jìn)行。但研究發(fā)現(xiàn)，光照條件在誘導(dǎo)分化、減少褐化、提升次生代謝物含量方面均優(yōu)于傳統(tǒng)暗條件[5]。對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)，認(rèn)為從2 d起應(yīng)在每日12 h的1 000—2 000 lx光照下培養(yǎng)[13, 37]；或應(yīng)在每日16 h的2 000—3 000 lx光照下培養(yǎng)[31]；對(duì)于繼代培養(yǎng)，應(yīng)給予每日12 h[8]乃至于16 h[26]的光照；而在進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，在3 000 lx的連續(xù)光照下培養(yǎng)，次生代謝物含量最高；在2 000 lx光照下培養(yǎng)，細(xì)胞增長(zhǎng)最快[15]。這可能是由于光照條件下愈傷組織的代謝更偏向于自養(yǎng)型，在有害物質(zhì)生成減少的同時(shí)促進(jìn)了葉綠體的分化。有研究指出黃酮含量與葉綠素含量成正相關(guān)[68]，生成的葉綠體或?yàn)辄S酮合成提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，這一觀點(diǎn)還需進(jìn)一步研究提供證據(jù)。

由于PPO在 30 ℃ 下活性最大[69]，全過程培養(yǎng)時(shí)環(huán)境溫度都不宜過高，應(yīng)穩(wěn)定在25 ℃ 左右。也有研究認(rèn)為降低到 20 ℃ 可以大大減少褐化發(fā)生[70]；由于PPO在 pH 為5.6時(shí)活性最大[71]，中性、堿性的培養(yǎng)基可以減少褐化[20]。從此方面考慮，雖然黃酮和內(nèi)酯產(chǎn)量最大的pH可能不同[15]，但在綜合考慮下，最佳pH仍為5.8。

此外，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，用通氣較為不良的介質(zhì)封口，如塑料膜[15]或玻璃紙[72]，可以提升黃酮和內(nèi)酯的產(chǎn)量。這或許揭示了不良通氣狀況可通過缺氧脅迫細(xì)胞誘導(dǎo)其產(chǎn)生次生代謝物。但也有研究認(rèn)為低溫預(yù)處理和黑暗預(yù)處理能夠減少褐化[73]。

5 小結(jié)與展望

銀杏含有多種藥用次生代謝物，對(duì)其組織培養(yǎng)技術(shù)的探究將有利于更廣泛地開發(fā)和應(yīng)用其價(jià)值。但該技術(shù)面臨許多難點(diǎn)，如污染嚴(yán)重、褐化率高、次生代謝物產(chǎn)量低于自然水平等。針對(duì)這些問題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者自上世紀(jì)以來不斷對(duì)方案進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，總體取得了良好的成效。

據(jù)總結(jié)優(yōu)化，可選用帶腋芽的莖段或成熟胚作為外植體材料。胚外植體用4 ℃低溫保存，莖外植體隨采隨用。取材后將外植體在洗衣粉溶液中浸泡20 min，用流水沖洗40 min，后用蒸餾水漂洗干凈，擦干后進(jìn)入消毒環(huán)節(jié)。消毒時(shí)注意無菌操作，先用75%乙醇初步消毒45 s，再轉(zhuǎn)用0.1% HgCl2溶液消毒8 min。消毒后立即接種在培養(yǎng)基上，并注意盡量減少與培養(yǎng)基的接觸面積。

在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，應(yīng)選用NAA與6-BA配合使用，降低蔗糖濃度至20 g/L，適當(dāng)增加瓊脂含量至9 g/L，并適當(dāng)添加抗褐變?cè)噭?如2 g/L AC)和其他有益化合物。40 d后，若繼續(xù)培養(yǎng)，則可進(jìn)一步形成完整植株；若進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，則可以在培養(yǎng)基配方中去除瓊脂，將愈傷組織剪碎以30 g/L接種到液體培養(yǎng)基中，用透氣性較差的介質(zhì)封口后，在120 r/min的搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，20 d后收獲。在全過程中，應(yīng)注意控制溫度在22 ℃左右，pH在5.8以上，并給予2 000 lx 左右的光照條件。

同時(shí)，研究也正在討論一些新的優(yōu)化方案，如：在消毒環(huán)節(jié)中升汞溶液效果較好但毒性較大，是否能夠用其他消毒劑的結(jié)合使用代替升汞溶液消毒，提高操作安全性；培養(yǎng)基中對(duì)糖類物質(zhì)的應(yīng)用是否有更優(yōu)方案等。

綜合而言，為解決污染問題，應(yīng)注意試驗(yàn)過程中全程的無菌操作，同時(shí)在消毒環(huán)節(jié)時(shí)特別注意消毒劑的使用。而針對(duì)褐化問題，現(xiàn)有討論的主要焦點(diǎn)在于抗褐變?cè)噭┑奶砑邮褂谩?jù)本文總結(jié)，抗褐變?cè)噭┑氖褂没蛟S并不能產(chǎn)生決定性影響，若想真正解決褐化問題，應(yīng)從培養(yǎng)基本身的營(yíng)養(yǎng)和激素條件，以及培養(yǎng)的溫濕度、光照等外環(huán)境條件方面著手，使各方面條件符合愈傷組織要求，以使其代謝趨于正常，有害物質(zhì)生成減緩。另外，也有學(xué)者認(rèn)為銀杏各品種之間的差異，即基因水平上的差異，是褐化率的重要影響因子之一[21]。是否使用抗褐化劑、使用何種抗褐化劑，是當(dāng)前研究探討的重點(diǎn)，對(duì)木本植物組織培養(yǎng)中褐變?cè)淼倪M(jìn)一步更加完善的分子生物學(xué)分析是未來有助解決褐化問題的探索方向。如果能尋找并培育出特異性吞噬酚類物質(zhì)的工程菌，將其接種到培養(yǎng)基中，或許可以同時(shí)使褐變與污染問題得到較大改善。

同時(shí)，在為提高黃酮和內(nèi)酯產(chǎn)量的研究中，不豐富的氮源、一定范圍內(nèi)的低溫、較高的滲透壓、較不充足的氧氣等條件都有利于銀杏次生代謝物的積累，而這些條件都會(huì)對(duì)組織細(xì)胞生長(zhǎng)造成一定的脅迫。這可能是因?yàn)樵诩?xì)胞中，初生代謝與次生代謝具有一定的沖突。當(dāng)細(xì)胞的正常環(huán)境較為不適宜時(shí)，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多的次生代謝物。在培養(yǎng)過程中，探索不同脅迫因子的影響，尋找初生代謝與次生代謝的最佳平衡點(diǎn)，是進(jìn)一步研究的方向。

無糖條件可以在光照條件輔助下誘導(dǎo)愈傷組織分化出葉綠體，使代謝途徑更偏向自然條件下的自養(yǎng)型代謝，其有利于減少有害物質(zhì)的生成，同時(shí)也促進(jìn)次生代謝物的合成。于此同時(shí)，無糖條件也減少了異養(yǎng)微生物的生存可能，故可以同時(shí)減少褐化率和污染率。因此，應(yīng)用近幾年來興起的無糖組織培養(yǎng)技術(shù)，將光照和二氧化碳作為碳源，促使愈傷組織進(jìn)行自養(yǎng)型代謝，也是較好的優(yōu)化方向。

另外，現(xiàn)有優(yōu)化大多停留在方案和技術(shù)層面上，沒有深入探究其機(jī)理。故在今后的研究中，對(duì)銀杏組織培養(yǎng)過程中更多的生物化學(xué)分析，甚至分子生物學(xué)分析，或許可以更好地改進(jìn)技術(shù)、優(yōu)化方案，進(jìn)一步提高銀杏組織培養(yǎng)的成功率，為進(jìn)一步研究在長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)中保持次生代謝物合成，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供良好基礎(chǔ)。

致謝 感謝鄧秋萍老師、陳璟老師在課題選題階段提供的支持；感謝常小光老師在初稿寫作過程中給予的建議；感謝劉佳曄同學(xué)在論文修改過程中給予的幫助。