李中騫 石鑫岳 許敏

(1內(nèi)蒙古巴彥淖爾市醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000;2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)繼發(fā)腦病是一種全身多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病，也是SLE最嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，其中出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害是SLE病情危重的臨床征兆，也是SLE危象導(dǎo)致死亡的主要原因之一，對(duì)其確切的病因目前尚未明確〔1，2〕。SLE腦病臨床表現(xiàn)多樣，其可發(fā)生在 SLE 病程的任何時(shí)間，病情呈反復(fù)發(fā)作與緩解交替，而且大部分患者預(yù)后均較差，且主要以激素治療為主，對(duì)于老年患者激素治療不良反應(yīng)大、并發(fā)癥及死亡率高，探討新的副作用小的藥物意義重大〔3，4〕。研究報(bào)道烏司他丁是人體內(nèi)的一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，具有廣泛的生物活性，可減輕腦損傷后對(duì)機(jī)體造成的病理?yè)p害，研究表明烏司他丁可對(duì)嚴(yán)重的心、腦、肺等損害發(fā)揮顯著治療作用，是目前治療SLE的潛力藥物〔5，6〕。本研究擬通過(guò)烏司他丁對(duì)比潑尼松干預(yù)，觀察二者對(duì)老年SLE小鼠繼發(fā)SLE腦病腦組織中趨化因子 CXCL12 及其受體CXCR4 mRNA、蛋白表達(dá)的影響，初步探討烏司他丁對(duì)老年SLE繼發(fā)腦病小鼠神經(jīng)功能的保護(hù)及對(duì)死亡率的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性MRL/lpr SLE小鼠，14月齡。90只，體重41～45 g，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(蒙)2009-0001。SPF環(huán)境中，正常飼料喂養(yǎng)，自由飲水。主要試劑：烏司他丁(國(guó)藥準(zhǔn)字H19990133，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)；醋酸潑尼松龍注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20023134，浙江仙琚制藥股份有限公司);乙二胺四乙酸(EDTA，天津市化學(xué)試劑一廠)；Tunnel試劑盒(Roche公司)；mRNA提取試劑盒、Taq酶(美國(guó)MBI);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(大連寶生生物公司提供)；CXCL12、CXCR4、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由北京賽百勝生物技術(shù)公司合成；CXCL12、CXCR4單克隆抗體(SANTA公司產(chǎn)品)；GAPDH兔抗鼠多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)； Morris水迷宮DMS-2系統(tǒng)(中國(guó)科學(xué)院藥物研究所)；Morris水迷宮分析軟件(荷蘭Noldus公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)；超凈工作臺(tái)( 蘇州安泰空氣技術(shù)公司)；熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；凝膠成像系統(tǒng)(日本Kodak)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥 90只雄性MRL/lpr SLE小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分組，每組30只，分為空白組：腹腔注射生理鹽水30 mg/(kg·d)；烏司他丁組：腹腔注射烏司他丁給藥50 000 U/(kg·d);潑尼松組：腹腔注射潑尼松給藥1 mg/(kg·d)，腹注給藥15 d，間隙15 d，給藥4個(gè)月。

1.2.2小鼠學(xué)習(xí)記憶行為測(cè)定 各組SLE小鼠學(xué)習(xí)記憶行為測(cè)定(跳臺(tái)法)將小鼠放入YLS-3T跳臺(tái)記錄儀內(nèi)，適應(yīng)60 s后通電(25 V)，小鼠受到電擊。其正常反應(yīng)為跳至平臺(tái)上對(duì)傷害性刺激進(jìn)行躲避。對(duì)小鼠首次找到平臺(tái)所需的時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間)以及300 s內(nèi)受到電擊次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))進(jìn)行記錄，作為其學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。對(duì)小鼠第1次從平臺(tái)上跳下的時(shí)間(潛伏期)以及錯(cuò)誤次數(shù)進(jìn)行記錄，作為其記憶成績(jī)。

1.2.3血腫瘤壞死因子(TNF)-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的測(cè)定 各組隨機(jī)取5只分別于干預(yù)中期(2個(gè)月)及末期(4個(gè)月)取血3 ml(以200 g/L的烏拉坦按1.2 g/kg經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定，心臟穿刺取血3 ml)，收集的血液靜置30 min，常溫離心(3 700 r/min；10 min)，取血清，分裝(100 μl/EP管)后置于-80℃深低溫冰箱，備用。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清TGF-β、TNF-α表達(dá)水平。

1.2.4各組存活率 記錄各組自然死亡情況，以每個(gè)月為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，繪制小鼠存活率的曲線圖。

1.2.5病理檢測(cè) 動(dòng)物處死后，取小鼠腦組織通過(guò)10%甲醛固定，予以石蠟包埋，常規(guī)切片4 mm，80℃烤箱烤片后對(duì)組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色：蘇木素染色5 min后，經(jīng)自來(lái)水沖洗，鹽酸乙醇分化10 s，再次自來(lái)水沖洗10 min，伊紅染色7 min，自來(lái)水洗后，以梯度乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明，通過(guò)中性樹(shù)膠封固。中性樹(shù)膠封片后鏡檢。

1.2.6TUNEL染色 參照TUNEL試劑盒說(shuō)明步驟操作，取小鼠腦組織石蠟切片經(jīng)脫蠟及梯度酒精進(jìn)行脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，5 min/次，檸檬酸緩沖液(pH6.0)行微波修復(fù)15 min，37℃下蛋白酶K消化30 min，3%過(guò)氧化氫(H2O2)進(jìn)行封閉后、PBS洗3次，5 min/次，DNaseI反應(yīng)液制作陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)10 min，PBS洗3次，5 min/次，加入50 μl的末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(TdT)反應(yīng)液50 μl，避光37℃下反應(yīng)60 min，PBS洗3次，5 min/次，加入免疫組化(IHC)工作液，37℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗3次，5 min/次，二氨基聯(lián)苯酸(DAB)呈色、梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封片，熒光顯微鏡下對(duì)10個(gè)200倍視野進(jìn)行觀察，計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.7RT-PCR 取50 mg小鼠腦組織，液氮中研碎，加入預(yù)分裝的1 ml Trizol溶液中提取RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA含量，按MMLV 試劑盒步驟將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再將cDNA進(jìn)行RT-PCR。

按照Trizol說(shuō)明書(shū)方法提取組織總RNA，以總RNA 為模板、Oligo (dT) 為引物，通過(guò)RT-PCR兩步法試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，CXCL12：上游5′-GTCAGCCTGAGCTACCGA-3′，下游5′-GAAGGGCACAGTTTGGAG-3′；CXCR4：上游5′-GGCTGACCTCCTCTTTGT-3′，下游5′-GTTTCCTTGGCCTTTGAC-3′；GAPDH：上游5′-ACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3′,下游5′-GGCCTTGACTGTGCCGTTGAATTT-3′。95℃預(yù)變性1 min，95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，通過(guò)凝膠圖像處理系統(tǒng)分析光密度，以CXCL12、CXCR4基因片段與GAPDH片段灰度值的比值作為其相應(yīng)表達(dá)水平。

1.2.8Western印跡 將RT-PCR提取剩余物以1 500 r/min離心30 min，取上清粗體蛋白，用Bradford法行蛋白定量。5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠恒壓60 V，3.5 h，14 V恒壓濕轉(zhuǎn)14 h，37℃搖床上封閉2 h，待轉(zhuǎn)印后加入一抗：兔抗小鼠CXCL12 抗體或兔抗小鼠CXCR4抗體(1∶800)4℃過(guò)夜；兔抗小鼠GAPDH(1∶5 000)4℃過(guò)夜。TBST洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗體1∶700，37℃搖床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4次。DAB顯色。重復(fù)3次。Quantity One圖像分析。CXCL12、CXCR4與β-actin灰度比值進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各學(xué)習(xí)記憶行為分析 3組學(xué)習(xí)能力潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)；空白組記憶能力潛伏期顯著低于其余兩組(P<0.05)，而3組記憶能力錯(cuò)誤次數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶行為分析

2.2各組TNF-α、TGF-β水平比較 藥物干預(yù)2、4個(gè)月，空白組TNF-α水平顯著高于其余兩組，TGF-β水平顯著低于其余兩組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組TNF-α 、TGF-β水平比較

2.3各組存活率比較 藥物干預(yù)4個(gè)月，空白組、潑尼松組、烏司他丁組存活〔21只(70.0%)、24只(80.0%)、28只(93.3%)〕。烏司他丁組存活率顯著高于其余兩組(P<0.05)。

2.4各組腦組織病理 空白組腦組織中可見(jiàn)大量炎性因子、散在出血點(diǎn)，組織水腫，神經(jīng)元細(xì)胞受到抑制；而潑尼松組和烏司他丁組以上的病理變化大大減輕或消失，神經(jīng)元細(xì)胞增生較空白組活躍，見(jiàn)圖1。

圖1 各組腦組織(HE染色，×40)

2.5各組腦組織細(xì)胞凋亡 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞呈綠色熒光的為陽(yáng)性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)，潑尼松組(27.23±3.46)個(gè)/高倍鏡和烏司他丁組(28.48±3.76)個(gè)/高倍鏡，空白組腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)(67.54±4.38)個(gè)/高倍鏡，烏司他丁組和潑尼松組細(xì)胞凋亡水平顯著低于空白組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組腦組織凋亡(TUNEL，×200)

2.6各組腦組織中CXCL12和CXCR4 mRNA水平比較 3組CXCL12、CXCR4 mRNA水平比較：空白組>潑尼松組>烏司他丁組(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

2.7各組腦組織中CXCL12和CXCR4 蛋白水平比較 3組CXCL12、CXCR4 蛋白水平比較：空白組>潑尼松組>烏司他丁組(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表4。

表3 各組腦組織中CXCL12和CXCR4 mRNA 水平比較

圖3 各組腦組織中CXCL12和CXCR4 mRNA水平比較

圖4 Western印跡檢測(cè)CXCL12、CXCR4蛋白水平比較

表4 各組腦組織中CXCL12和CXCR4蛋白 水平比較

3 討 論

SLE小鼠繼發(fā)腦病后，一般預(yù)后不良，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。SLE腦病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，研究表明其發(fā)病機(jī)制可能與免疫復(fù)合物沉積性血管炎、磷脂抗體的損害、抗神經(jīng)元抗體及腦組蛋白抗體反應(yīng)、抗核糖體 P蛋白抗體致病、低蛋白血癥等因素有關(guān)〔7〕。此外SLE腦病的臨床表現(xiàn)也各異，又受遺傳、環(huán)境等因素的影響。臨床上對(duì)此病的治療主要有免疫抑制劑治療、激素療法及對(duì)癥治療等，但均未能徹底治療，且激素治療副作用嚴(yán)重，對(duì)于老年患者發(fā)生股骨頭壞死及感染等并發(fā)癥概率增加〔8，9〕。

烏司他丁是一種廣譜酶抑制劑，有抗休克、抑制炎癥因子、玻璃酸酶、 胰蛋白酶、纖溶酶和彈性蛋白酶等多種酶的活性及清除自由基等作用，研究報(bào)道稱烏司他丁是從男性新鮮尿液中提取的一種糖蛋白，對(duì)休克、手術(shù)傷害、腫瘤放化療反應(yīng)等可發(fā)揮輔助治療作用〔8，9〕。有研究認(rèn)為，鳥(niǎo)司他丁發(fā)揮療效的作用機(jī)制可能為：抑制機(jī)體蛋白質(zhì)的分解亢進(jìn)，改善免疫功能，改善腎功能，減輕腦損傷后的腦水腫、水電解質(zhì)紊亂、意識(shí)模糊、消化道出血、代謝失衡、感染等〔10～12〕。

本研究結(jié)果提示烏司他丁可能通過(guò)提高小鼠神經(jīng)元細(xì)胞活躍性，增強(qiáng)小鼠的記憶能力、學(xué)習(xí)記憶行為；烏司他丁通過(guò)調(diào)低CXCL12 及其受體CXCR4的表達(dá)水平，抑制SLE小鼠繼發(fā)腦病效果好。