徐敏 岳峰 宋勃 周松 黃晶 田水 劉啟方

(貴州省人民醫(yī)院 1康復(fù)科，貴州 貴陽 550002；2心內(nèi)科)

miR-25 在心肌細胞中高表達，參與心肌細胞凋亡和心室重構(gòu)等病理生理的調(diào)節(jié)〔1〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1是非染色體核蛋白，可導(dǎo)致心肌細胞凋亡及心肌纖維化〔2〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1具有誘導(dǎo)生長能力，在心肌間質(zhì)細胞、心肌細胞中均有表達，在心肌細胞凋亡發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用〔3,4〕。本課題既往研究證實miR-25靶向調(diào)控HMGB1的表達〔5〕，miR-25和HMGB1均具有調(diào)控心肌細胞凋亡的作用，但二者調(diào)控心肌細胞凋亡與TGF-β1有何種關(guān)系，本研究將進行探討。

1 材料和方法

1.1材料 細胞株H9C2心肌細胞來源于胚胎期心臟組織的細胞，購于中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、考馬斯藍染色(Bradford)蛋白濃度測定試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物有限公司；TGF-β、Smad蛋白、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)-3、HMGB1和B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl)-2抗體購自Gibco公司；SB-431542試劑購于上海嶸崴達實業(yè)有限公司。慢病毒載體由上海吉凱公司構(gòu)建。

1.2方法

1.2.1分組及轉(zhuǎn)染 H9C2細胞培養(yǎng)24 h 后進行慢病毒感染,向轉(zhuǎn)染組細胞懸液中加入凝聚胺(polybrene)溶液及慢病毒載體。空白對照(control) 組未進行轉(zhuǎn)染;陰性對照(Lv-control) 組轉(zhuǎn)染Lv-control-miRNA模擬物(mimic)；Lv-anti-control組轉(zhuǎn)染Lv-control-miRNA-抑制劑(inhibitor);Lv-miR-25組轉(zhuǎn)染Lv-miR-25 mimic；Lv-anti-miR-25組轉(zhuǎn)染Lv-miR-25 inhibitor。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 試劑盒說明，Contol-shRNA組轉(zhuǎn)染control-shRNA；HMGB1-shRNA組轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA，經(jīng)培養(yǎng)后篩出穩(wěn)定細胞系。選取高表達miR-25 H9C2心肌細胞，Lv-miR-25組轉(zhuǎn)染Lv-miR-25 mimic，Lv-miR-25+SB431542組轉(zhuǎn)染Lv-miR-25 mimic后加入TGF-β1/smads抑制劑SB431542共培養(yǎng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后予缺氧/復(fù)氧處理，缺氧培養(yǎng)箱(37℃、1% O2、5% CO2、94% N2)培養(yǎng)24 h后行復(fù)氧培養(yǎng)箱(95%空氣和5% CO2)1 h〔6〕。

1.2.2Western印跡檢測蛋白表達 Western 印跡法檢測HMGB1、Bcl-2、Cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad3、磷酸化(p)-Samd3、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、p-ERK1/2蛋白表達。RIPA裂解液提取細胞總蛋白，蛋白定量后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉及洗膜后，均加入按照1∶1 000稀釋好的cleaved caspase-3、Bcl-2、HMGB1、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、ERK1/2、p-ERK1/2抗體，4℃搖床孵育24 h，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集缺氧/復(fù)氧處理的細胞，制備成105/ml 濃度的細胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，離心棄上清重懸細胞，加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)5 μl和碘化丙啶(PI)10 μl，室溫孵育15 min，上流式細胞儀分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。Bonferroni法進行組間均數(shù)的兩兩比較，多組數(shù)據(jù)的比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-25調(diào)控HMGB1及細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達 Lv-miR-25組HMGB1、Cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯低于Control組、Lv-control組、Lv-anti-control組、Lv-anti-miR-25組(均P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯高于Control組、Lv-control組、Lv-anti-control組、Lv-anti-miR-25組(均P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

表1 各組H9C2細胞中HMGB1、Bcl-2和Cleaved caspase-3 蛋白表達比較

2.2HMGB1調(diào)控TGF-β1、Smad蛋白及細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達 與Contol-shRNA組相比，HMGB1-shRNA 組HMGB1、TGF-β1蛋白、p-Smad3、Cleaved caspase-3蛋白表達顯著下降、Bcl-2蛋白表達顯著上升(P<0.05)。兩組ERK1/2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、圖4、表2。

1～5：Control組、Lv-control組、Lv-miR-25組、Lv-anti-control組、Lv-anti-miR-25組；圖2同圖1 miR-25高表達對H9C2心肌細胞 HMGB1表達的影響

圖2 miR-25高表達對H9C2心肌細胞凋亡 相關(guān)蛋白表達的影響

圖3 沉默HMGB1表達對H9C2心肌細胞 TGF-β1表達的影響

圖4 沉默HMGB1表達對H9C2心肌細胞凋亡 相關(guān)蛋白表達的影響

表2 各組H9C2細胞中HMGB1、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達比較

2.3TGF-β1/Smads信號通路調(diào)控細胞凋亡 相對于Lv-miR-25組，Lv-miR-25+SB431542組Cleaved caspase-3表達顯著增加，Bcl-2蛋白表達顯著下降(均P<0.05)，提示細胞凋亡減少。相對于Lv-miR-25組，Lv-miR-25+SB431542組凋亡細胞明顯減少(16.17%±3.06% vs 6.13%±1.26%P<0.05)，見圖5、表3。

圖5 TGF-β1抑制劑對H9c2心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達及凋亡率的影響

表3 各組H9C2細胞中Bcl-2和Cleaved caspase-3 蛋白表達比較

3 討 論

細胞凋亡是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及多種亞細胞器和細胞分子。研究表明缺血缺氧和再灌注損傷引起的細胞凋亡是通過線粒體途徑完成的，Bcl-2家族、caspase家族在細胞凋亡過程中均發(fā)揮重要作用。Bcl-2 的表達下調(diào)，caspase-3表達上調(diào)，引起心肌細胞凋亡；Bcl-2表達上調(diào)及caspase-3表達下調(diào)對心肌細胞凋亡起抑制作用〔7〕。本研究通過高表達miR-25，檢測凋亡相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示Bcl-2表達上調(diào)及caspase-3表達下調(diào)，對心肌細胞凋亡具有保護作用。HMGB1 在心血管疾病發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮重要的作用。Foglio等〔8〕研究在心肌梗死大鼠模型試驗中，給予HMGB1治療，能夠降低caspase-3表達，減輕心肌細胞凋亡率。Hu等〔9〕報道HMGB1在心肌缺血再灌注損傷中扮演著重要的作用，能夠?qū)е滦募〖毎蛲?，給予HMGB1抗體處理，能夠顯著增加Bcl-2蛋白表達及較少的凋亡細胞，其作用通過調(diào)控白細胞介素-17A。本研究發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)染shRNA-HMGB1抑制H9C2細胞HMGB1的表達，檢測凋亡相關(guān)蛋白表達，Bcl-2表達上調(diào)及caspase-3表達下調(diào)，心肌細胞凋亡減少。檢測TGFβ1、p-Smad蛋白表達下降，HMGB1的表達下降具有下調(diào)TGF-β1、p-Smad蛋白的作用。TGF-β1 是一種的具有眾多功能的細胞因子，TGF-β1 及受體在心肌間質(zhì)細胞、心肌細胞中均有表達，它通過調(diào)控特殊的信號通路誘導(dǎo)心肌細胞的凋亡〔10，11〕。Wua等〔12〕研究顯示，miR-202-3p通過負向調(diào)控TRPM6的表達，抑制TGF-β1/smads信號通路減少缺血再灌注損傷所致的心肌細胞凋亡。本研究通過使用TGF-β1抑制劑SB431542與高表達miR-25 H9C2細胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示相對于單純高表達miR-25細胞組，使用TGF-β1抑制劑SB431542能夠進一步抑制心肌細胞凋亡。由此推斷下調(diào)TGFβ1表達能夠降低心肌細胞凋亡。miR-25具有靶向調(diào)控HMGB1的作用。本研究證實HMGB1的表達下降能夠下調(diào)TGF-β1蛋白的表達，TGF-β1具有調(diào)控細胞凋亡的作用，因此得出miR-25通過HMGB1影響TGF-β1/smads信號通路參與保護心肌細胞凋亡的作用。但心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致細胞凋亡是眾多因素共同作用的復(fù)雜過程，各種細胞因子之間錯綜復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系及轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控都扮演著重要的作用，本研究僅僅探討心肌細胞凋亡調(diào)控的一種途徑。