王耀坤 張尚衡 楊克科 馬小茹 王淑秋 王淑湘 陳光 王芳芳

(1佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部，黑龍江 佳木斯,154007；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯分校；3臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院)

糖尿病腎病(DKD) 是糖尿病患者的主要并發(fā)癥，也是導(dǎo)致全球糖尿病患者病死率升高和社會(huì)醫(yī)療資源消耗的主要原因之一〔1〕。此外，DKD也是世界范圍內(nèi)引起終末期腎病(ESRD)最常見原因。目前臨床治療手段包括控制血壓和血糖、降血脂及保證腎功能，終末期患者使用透析或腎臟移植治療等，雖然能夠減緩疾病的進(jìn)展，但無法控制其他并發(fā)癥的出現(xiàn)。腎臟是高能耗器官，糖代謝非常旺盛，腎臟通過糖異生、葡萄糖利用以及再吸收腎小球?yàn)V液中的葡萄糖在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。高血糖與腎臟病密切相關(guān)，高血糖會(huì)改變腎臟的能量代謝，高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞線粒體蛋白減少，氧化磷酸化受到嚴(yán)重影響〔2〕。除糖代謝外，腎臟脂質(zhì)代謝也非常旺盛，脂質(zhì)代謝與慢性腎臟病密切相關(guān)，慢性腎臟病患者在腎功能不全早期即存在血脂異常，且血脂異常往往隨著腎功能的惡化而加重。脂質(zhì)代謝異?？梢l(fā)腎臟炎癥〔3〕、氧化應(yīng)激〔2〕和自噬〔4〕。

轉(zhuǎn)化生子因子(TGF)-β是一種多功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子，其中TGF-β1屬于促炎性細(xì)胞因子，在DKD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用〔5〕。TGF-β1是作用最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子，介導(dǎo)多種信號(hào)參與腎纖維化的發(fā)生發(fā)展〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)〔7,8〕，TGF-β1作用于體外培養(yǎng)或高糖狀態(tài)下的腎小球系膜細(xì)胞(MC)后，明顯增加了磷酸化的膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)的表達(dá)，并且呈時(shí)間依賴性，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)MC內(nèi)脂質(zhì)沉積密切相關(guān)。然而關(guān)于TGF-β1是如何活化SREBPs調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝目前還沒有完全闡明。本研究通過體外培養(yǎng)MC，分析TGF-β1活化SREBP1誘導(dǎo)脂代謝異常的作用機(jī)制及其SREBP1對(duì)TGF-β1轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的重要作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 大鼠MC(SD大鼠腎臟原代分離培養(yǎng))；Smad3 KO大鼠MC(由Joan Krepinsky惠贈(zèng))；DMEM 培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Sigma公司)；TGF-β1(美國 R&D公司)；Effentene轉(zhuǎn)染試劑(德國Qiagen公司)；SREBP1 siRNA(美國Dharmacon公司)；Fatostatin(美國Chembridge公司)；絲氨酸蛋白酶抑制劑(AEBSF，德國Calbiochem公司)；wortmannin、rapamycin和LY2940-02(美國Sigma)；Akt inhibitor Ⅷ(美國EMD公司)；SB431542 (英國Tocris公司);鼠抗SREBP1抗體、羊抗CCCTC結(jié)合因子(CTGF)抗體、抗纖維連接蛋白(FN)抗體(美國Santa Cruz公司)；兔抗環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)抗體、兔抗β-actin抗體(美國Cell Signaling公司)；兔抗AF-488 抗體(美國Invitrogen)；細(xì)胞培養(yǎng)耗材(美國Corning公司)；攜帶 TGF-β1基因腺病毒載體(AdTGF-β1)及腺病毒空載體(AdLacZ)、p3TP-Lux熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(由Joan Krepinsky惠贈(zèng))；pCMV-β-gal(美國Clontech公司)；細(xì)胞裂解液(美國Promega公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 雌性SD大鼠(200～250 g，6～8周齡)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分為兩組：對(duì)照組(AdLacZ組)和攜帶TGF-β1基因腺病毒載體(AdTGF-β1組)組。隨后進(jìn)行腎臟病毒液灌注：異氟烷麻醉的SD大鼠，于腹部正中線切開后PE10導(dǎo)管從腹主動(dòng)脈插入左腎動(dòng)脈，1.5 ml包含有5×109個(gè)單位的AdTGF-β1/AdLacZ的冷生理鹽水，利用注射泵進(jìn)行灌注。需要特殊強(qiáng)調(diào)的是腺病毒液中含有25 U肝素。灌注后第7天處死大鼠，取出左腎，行免疫組化(IHC)檢測(cè)SREBP1蛋白的表達(dá)情況。

1.2.2細(xì)胞的培養(yǎng)和分組處理 常規(guī)法分離培養(yǎng)原代大鼠的MC〔9〕，6～15次傳代。將MC分為以下9組：①Con組(無任何處理)；②TGF-β1組(2 ng/ml，3 h)；③T+Akti組(Akt inhibitor Ⅷ，10 μmol/L，處理1 h后加入TGF-β1處理3 h)；④T+rapa組(mTOR inhibitor，20 ng/ml，處理1 h后加入TGF-β1處理3 h)；⑤T+RI inh組(TβR1抑制劑SB431542,5 μmol/L,處理30 min后加入TGF-β1處理3 h)；⑥T+LY組(PI3K抑制劑LY294002，20 μmol/L，處理30 min后加入TGF-β1處理3 h)；⑦T+Wort組(PI3K抑制劑wortmannin，100 nmol/L，處理1 h后加入TGF-β1處理3 h)；⑧T+fato組(SCAP抑制劑Fatostatin，20 μmol/L,處理 1 h后，加入TGF-β1共同處理3 h)；⑨T+AEBSF組(S1P抑制劑AEBSF，500 μmol/L,處理1 h后加入TGF-β1處理3 h)。常規(guī)培養(yǎng)Smad3 WT/KO MC細(xì)胞，6～15次傳代。將Smad3 WT/KO MC細(xì)胞分為以下4組：①ConA組(Smad3 WT，無任何處理)；②TGF-β1A組(Smad3 WT,2 ng/ml，24 h)；③ConB組(Smad3 KO，無任何處理)；④TGF-β1B組(Smad3 KO，2 ng/ml，24 h)。另外將常規(guī)培養(yǎng)的Smad3 WT/KO MC細(xì)胞全部轉(zhuǎn)染p3TP-Lux后再次分為以下8組：①Con組C(Smad3 WT)；②TGF-β1C組(Smad3 WT，2 ng/ml，24 h)；③ConD組(Smad3 KO)；④TGF-β1D組(Smad3 KO，2 ng/ml，24 h)；⑤fatoA組(Smad3 KO，20 μmol/L,處理1 h)；⑥T+fatoA組(Smad3 KO，F(xiàn)atostatin，20 μmol/L,處理1 h后，加入TGF-β1共同處理3 h)；⑦ConE組(Smad3 KO,Con siRNA)；⑧TGF-β1E組(Smad3 KO，Con siRNA,2 ng/ml，24 h);⑨ConF組(Smad3 KO,SREBP1 siRNA)；⑩TGF-β1F組(Smad3 KO，SREBP1 siRNA,2 ng/ml，24 h)。

1.2.3免疫熒光檢測(cè)MC中SREBP1的核表達(dá) 處理后的MC細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，3.7%甲醛固定，0.1% Triton X-100在PBS中滲透，用抗SREBP1一抗(1∶100)孵育4℃過夜。 第2天室溫復(fù)溫30 min，洗去一抗，滴加二抗(1∶250) 稀釋并用于室溫孵育60 min，洗去二抗，滴加DAPI染核，避光孵育30 min，清洗后封片，圖像采集使用奧林巴斯IX81顯微鏡和Metamorph軟件。

1.2.4Western印跡檢測(cè)MC中mSREBP1、CTGF和FN蛋白表達(dá) MC培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整至2.5×105/ml，接種于直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿1 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞80%～85% 匯合，換無血清DMEM培養(yǎng)液24 h后收集細(xì)胞，提取核蛋白檢測(cè)SREBP1的表達(dá)；提取總蛋白檢測(cè)CTGF和FN的表達(dá)。蛋白上樣量為50 μg，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4℃過夜；TBST 洗滌后加入二抗室溫孵育2 h，TBST 再次洗滌后電化學(xué)發(fā)光(ECL)，以 X-膠片記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用吸光度值表示蛋白表達(dá)量。

1.2.5p3TP-Lux熒光素酶的活性檢測(cè) MC接種于12孔板，增殖匯合度達(dá)85%后轉(zhuǎn)染0.5 μg p3TP-Lux熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和0.05 μg pCMV-β-gal。轉(zhuǎn)染24 h后MC無血清培養(yǎng)過夜，TGF-β1處理24 h。細(xì)胞用冷PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解緩沖液凍融后，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(420 nm)檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的熒光素酶和β-gal活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1可誘導(dǎo)SD大鼠腎組織中SREBP1的活化 與AdLacZ組大鼠腎組織中SREBP1蛋白水平(182.7±5.51)相比，AdTGF-β1組(208.0±2.65)明顯增加(P<0.05)。見圖1。

圖1 TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腎組織中 SREBP1活化(免疫組化，×600)

2.2Fatostatin抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MC中SREBP1核移位 與Con組MC中SREBP1蛋白的核表達(dá)熒光強(qiáng)度(22.61±1.47)相比，TGF-β1組(35.54±0.81)明顯增加(P<0.05)。與TGF-β1組MC中SREBP1蛋白的核表達(dá)熒光強(qiáng)度相比，T+fato組(20.47±1.01)明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.3SCAP和S1P參與了TGF-β1誘導(dǎo)的SREBP1的活化 與Con組mSREBP1蛋白表達(dá)(1.000±0.000)相比，TGF-β1組明顯升高(1.637±0.117，P<0.05)。與TGF-β1組mSREBP1蛋白表達(dá)相比，T+fato組和T+AEBSF組均明顯降低(0.480±0.283，0.230±0.049，P<0.01),見圖3。與Con組GFP熒光強(qiáng)度(1.000±0.213)相比，TGF-β1組明顯增加(1.412±0.139，P<0.05)。與TGF-β1組GFP熒光強(qiáng)度相比，T+fato組明顯降低(0.779±0.234，P<0.05)。

圖2 SREBP1核移位情況(免疫熒光，×400)

圖3 Western印跡檢測(cè)核蛋白mSREBP1的表達(dá)

2.4PI3K/Akt信號(hào)通路參與了TGF-β1誘導(dǎo)的mSREBP1的活化 與TGF-β1組mSREBP1表達(dá)相比，T+LY組、T+Wort組、T+Akti組和T+rapa組均明顯降低(1.237±0.071，1.120±0.104，0.353±0.028，0.312±0.062，均P<0.05)。見圖4。

2.5TβR1非Smad3參與了TGF-β1誘導(dǎo)的mSREBP1的活化 與TGF-β1組相比，T+RIinh組明顯抑制了mSREBP1蛋白的表達(dá)(0.583±0.192，P<0.01)。見圖5。與ConB組mSREBP1表達(dá)(1.000±0.000)相比，TGF-β1B組(1.700±0.580)明顯升高。見圖6。ConB組Smad3 KO MC的p3TPLux熒光素酶活性(0.997±0.202)與TGF-β1B組(2.893±0.709)有顯著差異(P<0.05)。TGF-β1A組(4 817 731±179 434.93)和TGF-B1B組(4 553 297±128 252.37)mSREBP1蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見圖7。

圖4 PI3K/Akt信號(hào)通路參與了TGF-β1誘導(dǎo)的mSREBP1的活化

圖5 TβR1抑制劑對(duì)SREBP1蛋白表達(dá)的影響

圖6 TGF-β1對(duì)Smad3 KO MC SREBP1蛋白表達(dá)的影響

2.6SREBP1是TGF-β1轉(zhuǎn)錄反應(yīng)必須的調(diào)節(jié)子 與ConB組p3TP-Lux熒光素酶活性相比，TGF-β1D組(8.227±2.90)明顯增加(P<0.01)；與TGF-β1D組p3TP-Lux熒光素酶活性相比，T+fatoA組明顯降低(0.204±0.284，P<0.01)。TGF-β1E組p3TP-Lux熒光素酶活性(3.312±0.335)明顯高于TGF-β1F組(1.100±0.200，P<0.05)。與ConD組SREBP1下游促纖維化蛋白CTGF和FN蛋白(1.000±0.000，1.000±0.000)相比，TGF-β1D組均明顯升高(1.454±0.201，1.449±0.213，P<0.05)；與TGF-β1D組SREBP1下游促纖維化蛋白CTGF和FN蛋白相比，T+fatoA組則明顯降低(1.102±0.113，1.090±0.210，P<0.05)。見圖8。

圖7 TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3 WT和 KO MC pSREBP1的表達(dá)(免疫熒光，×400)

圖8 SREBP1是TGF-β1轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的調(diào)節(jié)子

3 討 論

SREBP1在脂質(zhì)代謝平衡中的作用至關(guān)重要，腎組織中具有轉(zhuǎn)錄活性的SREBP1a或SREBP1c過表達(dá)可導(dǎo)致腎小球硬化并伴隨TGF-β1、FN和膠原蛋白表達(dá)的升高〔10〕。SREBP1與TGF-β1信號(hào)通路之間存在著一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)回路：SREBP1表達(dá)增加上調(diào)了TGF-β1水平，這一效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致更明顯的纖維化〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1作用于體外培養(yǎng)或高糖狀態(tài)下的MC明顯增加了pSREBP1表達(dá)，呈時(shí)間依賴性。另外，TGF-β1誘導(dǎo)可引起MC的脂質(zhì)沉積，與SREBP1的活化密切相關(guān)〔8,12〕。本研究結(jié)果說明TGF-β1是SREBP1活化的誘導(dǎo)因子。

SREBPs在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成并與 SREBPs 剪切激活蛋白(SCAP)特異性結(jié)合形成非活性前體SREBPs(preSREBPs)；preSREBPs 在低膽固醇或不飽和脂肪酸的刺激下，消除與胰島素誘導(dǎo)基因(Insig)的相互作用，被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。之后 preSREBPs 通過位點(diǎn)1蛋白酶(S1P)和位點(diǎn)2蛋白酶(S2P)的蛋白質(zhì)水解后從高爾基體膜被釋放，剪切形成成熟 SREBPs(mSREBPs)，被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，從而促進(jìn)多種脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)〔12〕。本研究結(jié)果說明TGF-β1在活化SREBP1的過程中與SCAP和Insig密切相關(guān)。

TGF-β1促纖維化作用與磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)〔13〕。在某些情況下，Akt可能通過雷帕霉素復(fù)合物(mTORC)1激活SREBP1〔14〕。TGF-β1 作為重要的致纖維化因子，本研究結(jié)果證明，TGF-β1在誘導(dǎo)SREBP1活化過程中需要轉(zhuǎn)化生長因子受體(TβR)1而非Smad3的輔助。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1也明顯增加大鼠MC內(nèi)FAS和三酰甘油(TG)含量從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，與SREBP1的活化密切相關(guān)〔7,8〕。SREBP1表達(dá)增加誘導(dǎo)了TGF-β1及其信號(hào)途徑活化也是導(dǎo)致腎小球硬化的重要調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果說明SREBP1是TGF-β1轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的誘導(dǎo)因子，SREBP1在TGF-β1的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中是必不可少的。

綜上，TGF-β1是參與腎臟纖維化的重要致病因子之一。TGF-β1通過調(diào)節(jié)SREBP1轉(zhuǎn)錄活性影響DKD的糖脂代謝。其潛在的作用機(jī)制與SCAP、S1P、PI3K/Akt通路和TGF-β1的受體密切相關(guān)。