張瑋芳 元建華 李建旺 吳梅秋 邱名耀 許振勝

(1中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院腫瘤化療科，海南 ?？?570208；2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診內(nèi)科)

結(jié)腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率持續(xù)增高，居全球第三位，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康〔1,2〕。結(jié)腸癌手術(shù)后的生存率約為50%，且患者術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移使其致死率居高不下〔3〕。研究表明，微小RNA是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在癌癥進(jìn)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用〔4〕。微小RNA-204(miR-204)作為微小RNA的重要成員之一，其在腫瘤組織中異常表達(dá)，可影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲〔5〕。G蛋白偶聯(lián)受體C型家族(GPRC)5A的失調(diào)與肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等多種腫瘤相關(guān)〔6〕。本研究旨在探討miR-204過表達(dá)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑與儀器 人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(FHC)(南京科佰生物科技有限公司)。MaCoys 5A Medium培養(yǎng)基(美國(guó)Life Technologies Corporation公司)；DMEM/F12完全培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞板、Transwell板(美國(guó)Corning公司)；miR-204 mimic、miR-204 NC由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、胰蛋白酶(0.25%)、青霉素和鏈霉素混合液(雙抗)、RIPA裂解液、電化學(xué)(ECL)發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；GPRC5A兔多克隆抗體、羊抗鼠IgG二抗(艾博抗上海貿(mào)易有限公司)；基質(zhì)膠(上海前塵生物科技有限公司)。5333型PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；ELX-8081U型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；BBD6220型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；JS-780型全自動(dòng)凝膠成像儀(杭州得聚儀器設(shè)備有限公司)；MA100N型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將購買的HCT116細(xì)胞置于復(fù)蘇、離心(1 200 r/min，5 min)、棄去上清液，用MaCoys 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和0.1%雙抗)重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照上述方法，使用DMEM/F12完全培養(yǎng)基〔含胰島素(5 μg/ml)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(5 μg/ml )，霍亂毒素(10 ng/ml)，氫化可的松(100 ng/ml)〕培養(yǎng)FHC細(xì)胞收集并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 收集1.2.1處理的HCT116細(xì)胞，接種于六孔板上(1×105個(gè)/孔)，分為對(duì)照組、miR-204 mimic組、miR-204 NC組，培養(yǎng)細(xì)胞至匯合達(dá)60%左右。使用不含胎牛血清的MaCoys 5A培養(yǎng)基稀釋miR-204 mimic儲(chǔ)存液和lipo2000轉(zhuǎn)染液，添加至miR-204 mimic組孔板中；按照上述方法，將miR-204 NC儲(chǔ)存液稀釋后與lipo2000轉(zhuǎn)染液，添加至miR-204 NC組細(xì)胞孔板中；對(duì)照組不做任何處理。將以上各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換為含胎牛血清的MaCoys 5A培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h分別收集各組細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集1.2.1的FHC細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，胰酶消化收集，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置為正常組。以上每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.2.3qPCR 按照Trizol試劑盒說明書，分別提取1.2.2收集的FHC細(xì)胞及各組HCT116細(xì)胞中總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板配制qPCR體系，分別對(duì)miR-204、GPRC5A進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件設(shè)置：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循環(huán)。分別以U6、β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，計(jì)算各組miR-204、GPRC5A mRNA相對(duì)表達(dá)量。miR-204、GPRC5A、β-肌動(dòng)蛋白和U6引物序列，miR-204：上游引物：5′-CCTTTGTCATCCTATGCC-3′，下游引物5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′;GPRC5A：上游引物：5′-ATGGCTACAACAGTCCCTGAT-3′，下游引物5′-CCACCGTTTCTAGGACGATGC-3′；β-肌動(dòng)蛋白：上游引物：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′；U6：上游引物：5′-GTGCTCGCTTCGGCACATATAC-3′，下游引物5′-AAAAATATGGAACGCTCACGAATTTG-3′。以上引物序列均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2.4MTT比色法 收集1.2.2中各組HCT116細(xì)胞，用無血清MaCoys 5A Medium培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于96孔板(4×104個(gè)/孔)，分別于培養(yǎng)0 h、12 h、24 h后加入10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，避光保存4 h，棄去上清液，加入100 μl二甲基亞砜，搖床震蕩10 min，于酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm波長(zhǎng)時(shí)各組吸光度值(OD值)，并計(jì)算各組細(xì)胞存活率，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。存活率(%)=處理后OD值/0 h 時(shí)OD值×100%。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 收集1.2.2中各組HCT116細(xì)胞，使用200 μl無菌移液器輕輕劃痕，用PBS輕輕洗去懸浮細(xì)胞，記錄并在顯微鏡下觀察各組HCT116細(xì)胞遷移情況并拍照。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。利用ImageJ處理圖像，計(jì)算各組劃痕愈合率，愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠以1∶8比例稀釋，包被小室基底膜后，置于培養(yǎng)箱2 h。收集1.2.2中各組HCT116細(xì)胞，用不含胎牛血清的MaCoys 5A Medium培養(yǎng)基重懸(5×105個(gè)/ml)，取200 μl接種至上室，向每個(gè)孔底部加入200 μl完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定25 min，結(jié)晶紫染色25 min，風(fēng)干，高倍顯微鏡下拍照，分別隨機(jī)抽取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算視野細(xì)胞數(shù)均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Western印跡 收集1.2.2各組HCT116細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液，提取各組HCT116細(xì)胞總蛋白。取等量蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，37℃下，使用5%脫脂奶粉封閉4 h，依次加入GPRC5A(1∶1 000)、β-肌動(dòng)蛋白(1∶2 000)，室溫?fù)u床孵化過夜，洗膜后加入羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000)，室溫孵化2 h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。以全自動(dòng)凝膠成像儀觀察條帶并拍照，利用ImageJ處理圖片。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，計(jì)算GPRC5A蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將合成的GPRC5A 3′非翻譯區(qū)(UTR)miR-204識(shí)別序列，克隆至pmiRGlo載體，得pmiRGlo-GPRC5A-3′UTR-WT。另外對(duì)GPRC5A 3′UTR中miR-204識(shí)別區(qū)配對(duì)堿基進(jìn)行突變后，連接至pmiRGlo載體，得pmiRGlo-GPRC5A-3′UTR-MUT。收集1.2.1中的HCT116細(xì)胞，隨機(jī)分為GPRC5A 3′UTR-WT+miR-204 NC組、GPRC5A 3′UTR-WT+miR-204 mimic組、GPRC5A 3′UTR-MUT+miR-204 mimic組和GPRC5A 3′UTR-MUT+miR-204 NC組。分別使用pmiRGlo-GPRC5A-3′UTR-WT、pmiRGlo-GPRC5A-3′UTR-MUT質(zhì)粒按照lipo2000試劑說明書與miR-204 mimic、miR-204 NC對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染以上各組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。24 h后收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書步驟，添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑上機(jī)檢測(cè)。每孔的數(shù)值以螢火蟲熒光活性/海參熒光活性顯示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-204表達(dá)比較 與正常組miR-204水平(3.16±0.13)比較，對(duì)照組、miR-204 NC組、miR-204 mimic組miR-204表達(dá)均顯著降低(1.27±0.24，1.19±0.27，2.49±0.31，P<0.05)；與對(duì)照組和miR-204 NC組相比，miR-204 mimic組miR-204表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；對(duì)照組和miR-204 NC組miR-204表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組細(xì)胞存活率比較 miR-204 mimic組12、24 h細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組和miR-204 NC組(P<0.05)；miR-204 mimic組細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率比較

2.3各組劃痕愈合率比較 miR-204 mimic組HCT116細(xì)胞劃痕愈合率〔(16.98±5.29)%〕均顯著低于對(duì)照組〔(89.31±3.72)%〕和miR-204 NC組〔(82.74±4.49)%，均P<0.05〕；對(duì)照組和miR-204 NC組細(xì)胞劃痕愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.4各組侵襲細(xì)胞數(shù)量比較 miR-204 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)量〔(115.45±16.79)個(gè)〕顯著低于對(duì)照組〔(304.13±20.97)個(gè)〕和miR-204 NC組〔(298.62±18.26)個(gè)，P<0.05〕；對(duì)照組和miR-204 NC組侵襲細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 miR-204 mimic轉(zhuǎn)染對(duì)HCT1116 細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖2 miR-204mimic轉(zhuǎn)染對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

2.5各組GPRC5A mRNA和蛋白比較 miR-204 mimic組GPRC5A mRNA及蛋白水平均顯著低于對(duì)照組和miR-204 NC組(均P<0.05)；對(duì)照組和miR-204 NC組GPRC5A mRNA及蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

表2 miR-204 mimic轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞 GPRC5A mRNA及蛋白表達(dá)情況

圖3 Western印跡檢測(cè)GPRC5A的表達(dá)

2.6雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 經(jīng)microrna.org數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)顯示，miR-204與GPRC5A 3′UTR區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。與GPRC5A-3′UTR-WT+miR-204 NC組熒光素酶活性(0.91±0.05)顯著高于GPRC5A-3′UTR-WT+miR-204 mimic組(0.45±0.03，P<0.05)；GPRC5A-3′UTR-MUT+miR-204 NC組(0.85±0.05)、GPRC5A-3′UTR-MUT+miR-204 mimic組(0.84±0.06)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 miR-204與GPRC5A-3′UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

3 討 論

約40%結(jié)腸癌患者術(shù)后出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)情況〔7,8〕。miRNA是一類高度保守的單鏈非編碼RNA分子，其通過互補(bǔ)序列識(shí)別mRNA，抑制靶基因翻譯或使其降解，從而下調(diào)靶基因表達(dá)水平〔9〕。楊繼嵐等〔10〕發(fā)現(xiàn)miR-4465過表達(dá)能夠抑制HCT116細(xì)胞侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；葉進(jìn)軍等〔11〕發(fā)現(xiàn)患者血清中miR-183水平與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和侵襲程度相關(guān)；張威等〔12〕研究表明miR-1915參與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移行為，因此我們推斷多種miRNA可影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，參與結(jié)腸癌腫瘤形成及發(fā)展。研究表明，miR-204在肝癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁正常肝組織的表達(dá)量，并與肝癌惡性臨床病理特征有關(guān)〔13〕。本研究結(jié)果提示miR-204在結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)，可能作為抑癌基因。

鄭曉強(qiáng)等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-204能夠通過靶向抑制Sirt1小干擾RNA表達(dá)、促進(jìn)p53上調(diào)，能夠抑制霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的增殖能力；范曉紅等〔15〕發(fā)現(xiàn)，miR-204高表達(dá)能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示上調(diào)miR-204水平，能夠顯著抑制HCT116細(xì)胞的增殖。張小路等〔16〕通過靶向調(diào)控miR-204表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-204過表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞(SW-1990)遷移和侵襲；王建民等〔17〕發(fā)現(xiàn)miR-204過表達(dá)能夠抑制成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的增殖、遷移和侵襲能力；Li等〔18〕發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-204能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果表明上調(diào)HCT116細(xì)胞中miR-204表達(dá)水平，能夠抑制細(xì)胞遷移、侵襲能力。

研究發(fā)現(xiàn)，GPRC5A失調(diào)與癌癥發(fā)生密切相關(guān)〔19〕。黃華奇等〔20〕發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)GPRC5A，抑制肺癌細(xì)胞(A549)的增殖和遷移能力；Shrestha等〔21〕發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-204水平，能夠抑制GPRC5A表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖，但未對(duì)遷移、侵襲等細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行研究。本研究結(jié)果提示上調(diào)miR-204水平可抑制GPRC5A mRNA及蛋白表達(dá)，推測(cè)miR-204和GPRC5A可能存在靶向關(guān)系。本研究結(jié)果提示miR-204可能通過靶向抑制GPRC5A表達(dá)，調(diào)節(jié)人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲行為。

綜上，miR-204過表達(dá)可能通過靶向下調(diào)GPRC5A表達(dá)，進(jìn)而抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。