王大永 裴劍 洪銘巖 徐翔 高云鶴 鄭宇 王凱杰 崔建忠

(唐山市工人醫(yī)院 1神經(jīng)介入科，河北 唐山 063000；2神經(jīng)外科)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)指因顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、腦血管畸形等因素引起腦血管破裂，血液流至蛛網(wǎng)膜下隙而導(dǎo)致腦血管痙攣、遲發(fā)性缺血性神經(jīng)功能障礙、腦積水、腦水腫等一系列癥狀，其致死率和致殘率較高〔1～3〕。腦皮層血液微循環(huán)障礙及遲發(fā)性血管痙攣是SAH的主要生理過程，會(huì)導(dǎo)致腦缺血，甚至腦死亡〔4，5〕。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路激活在SAH過程中發(fā)揮腦和神經(jīng)保護(hù)作用〔6，7〕。木犀草素(Luteolin)為中藥木犀草莖葉中的黃酮類化合物，具有抗感染及保護(hù)心血管等多種生物學(xué)效應(yīng)〔8～10〕，但Luteolin對(duì)SAH過程中PI3K/Akt通路的調(diào)控作用及對(duì)腦皮層血液微循環(huán)的影響作用未見報(bào)導(dǎo)，本文探討Luteolin對(duì)SAH大鼠PI3K/Akt信號(hào)通路及皮層微循環(huán)的影響。

1 材料及方法

1.1材料 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～7 w育齡，體重200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔SCXK(粵)2018-0002〕。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h黑暗與12 h光照交替，24～25℃溫度。動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意本研究，批號(hào)為IACUC-01(2018060917)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循3R原則。Luteolin(山東臨沂艾澤拉斯生物公司，規(guī)格：20 mg)；蘇木素-伊紅(HE)染液(上海聯(lián)邁生物工程公司)；血栓素(TX)A2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(無(wú)錫市東林科技發(fā)展公司)；5-羥色胺酶ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；兔抗大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)抗體(北京索萊寶科技有限公司)；磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化(p)-PI3K抗體(武漢菲恩科技公司)；Akt及p-Akt抗體(美國(guó)Abcam)；RFLSIⅢ激光散斑血流成像系統(tǒng)(深圳市瑞沃德生命科技公司)；51600腦立體定向儀(美國(guó)Stoelting公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠SAH模型建立及分組給藥 50只大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)尾動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血0.3 ml備用，參照文獻(xiàn)〔11，12〕暴露枕骨，用腦立體定向儀將0.3 ml自體動(dòng)脈血注入枕大池，48 h后再次注入0.3 ml自體動(dòng)脈血建立SAH大鼠模型，以二次注入前有少量血液在穿刺部位滲出為造模成功(共50只)；另取10只大鼠同法注入0.3 ml生理鹽水于枕大池作為Sham組。將建模成功的大鼠分為SAH組、Luteolin〔13〕低(5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)劑量組及尼莫地平〔14〕組(0.1 mg/kg)，每組10只；各組均于造模成功后第2天開始腹腔注射給藥7 d，2次/d，Sham組與SAH組腹腔注射10 ml/kg生理鹽水。

1.2.2神經(jīng)功能評(píng)分 末次給藥12 h后參照文獻(xiàn)〔12〕按Garcia評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，具體操作如下：1～2分，刺激大鼠身體兩側(cè)無(wú)反應(yīng)，提尾懸空后肢時(shí)前肢無(wú)任何反應(yīng)；3～4分，刺激大鼠身體兩側(cè)反應(yīng)遲鈍，提尾懸空后肢時(shí)前肢輕微伸展，但伸展不對(duì)稱；5～6分，刺激大鼠身體兩側(cè)有轉(zhuǎn)頭反應(yīng)，提尾懸空后肢時(shí)前肢都伸出對(duì)稱，總分以6分計(jì)，每組大鼠分別評(píng)分取平均值。

1.2.3激光散斑血流成像系統(tǒng)記錄腦皮層微循環(huán)情況及檢測(cè)皮層微動(dòng)脈血管管徑及腦血流量(rCBF) 參照文獻(xiàn)〔15〕做透明顱窗進(jìn)行散斑成像操作，具體方法如下：用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露顱骨，用牙科鉆將頂骨約為3 mm×3 mm的區(qū)域磨薄至均勻透明狀，激光散斑成像儀按一定角度散發(fā)的光斑照射于顱窗表面，記錄600 s后，用散斑軟件計(jì)算同一部位皮層微動(dòng)脈血管管徑及局部rCBF。

1.2.4各組腦組織HE染色病理學(xué)檢測(cè) 每組隨機(jī)取5只，參照文獻(xiàn)〔12〕用活體灌注生理鹽水和4%多聚甲醛法取腦組織，截取大腦視交叉平面至橫裂腦組織，制作石蠟切片，脫蠟、水化后行HE染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5ELISA檢測(cè)腦組織TXA2和5-羥色胺水平 每組取剩下的5只大鼠，斷頭取腦，取新鮮基底動(dòng)脈處腦組織0.5 g，用組織勻漿液充分勻漿后，取均漿液，用ELISA試劑盒測(cè)TXA2和5-羥色胺水平。

1.2.6Western印跡檢測(cè) p-PI3K/PI3K、p-Ak/Akt及eNOS蛋白表達(dá) 取組織勻漿液，提取胞質(zhì)蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)蛋白濃度，200 μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜操作，滴加一抗體(PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS，1∶1 000稀釋倍數(shù))及內(nèi)參(β-actin，1∶2 000)抗體4℃孵育24 h，加入1∶1 000的羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)二抗溶液37℃孵育125 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Image-J軟件分析條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 SAH組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分〔(1.05±0.12)分〕顯著低于Sham組〔(5.99±0.11)分，P<0.05〕；Luteolin低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分〔(2.88±0.10)分、(3.52±0.11)分、(4.65±0.09)分〕依次顯著高于SAH組(P<0.05)，且呈劑量依賴性，Luteolin高劑量組與尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分〔(4.69±0.12)分〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2激光散斑成像染色組織病理?yè)p傷程度觀察 散斑成像記錄圖像顯示，Sham組腦皮層血液流動(dòng)豐富，紅色血管清晰可見；SAH組皮層血管不清晰，血液流動(dòng)較慢，且散斑軟件檢測(cè)微動(dòng)脈血管管徑及rCBF較Sham組顯著降低(P<0.05)；Luteolin低、中、高劑量組可見少量清晰血管及血液流動(dòng)，散斑軟件顯示微動(dòng)脈血管管徑及rCBF較SAH組依次升高且呈劑量依賴性(P<0.05)，Luteolin高劑量組與尼莫地平組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1，表1。

表1 各組微動(dòng)脈血管管徑、rCBF、TXA2、5-羧色胺、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及eNOS蛋白水平比較

2.3HE染色組織病理?yè)p傷程度觀察 Sham組海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰正常；SAH組海馬區(qū)可見大量神經(jīng)元細(xì)胞水腫、變性、輪廓模糊，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)核溶解、固縮、碎裂甚至核消失；Luteolin低、中、高劑量組及尼莫地平組神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死現(xiàn)象明顯改善，見圖2。

2.4Luteolin對(duì)微循環(huán)介導(dǎo)因子TXA2和5-羥色胺含量影響 SAH組TXA2和5-羥色胺含量較Sham組顯著升高(P<0.05)；Luteolin低、中、高劑量組TXA2和5-羥色胺含量較SAH組依次降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)，Luteolin高劑量組與尼莫地平組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖2 各組海馬組織(HE染色，×400)

2.5Luteolin對(duì)大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)水平影響 SAH組腦組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)較Sham組顯著降低(P<0.05)；Luteolin低、中、高劑量組及尼莫地平組腦組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及eNOS蛋白表達(dá)較SAH組依次升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)，Luteolin高劑量組與尼莫地平組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖3。

1～6：Sham組，SAH組，Luteolin低劑量組,Luteolin中劑量組,Luteolin高劑量組，尼莫地平組圖3 Western印跡檢測(cè)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及 eNOS蛋白表達(dá)

3 討 論

SAH發(fā)病率、致死率、致殘率逐年上升，嚴(yán)重威脅患者生命，大腦皮層血液微循環(huán)障礙和血管痙攣是導(dǎo)致患者腦死亡的主要原因〔4，5〕。目前臨床尚無(wú)治療SAH血液微循環(huán)障礙和血管痙攣安全有效的藥物，尼莫地平可改善SAH血液微循環(huán)障礙和血管痙攣，但價(jià)格昂貴、副作用較大，臨床應(yīng)用受到很大限制〔16〕。

中藥天然提取物L(fēng)uteolin對(duì)心血管疾病有保護(hù)作用，且安全性、有效性較高〔10〕，因此本研究推測(cè)Luteolin可能對(duì)SAH也有一定的治療作用，并采用經(jīng)典的枕大池二次注血方法構(gòu)建SAH模型〔17〕對(duì)此進(jìn)行探究，研究結(jié)果表明Luteolin可增加腦皮層血流量、改善微循環(huán)障礙，減少腦神經(jīng)元變性和死亡，改善SAH大鼠腦損傷。

eNOS可催化L-精氨酸肟末端的氮原子和氧分子產(chǎn)生一氧化氮(NO)，而NO可抑制血管內(nèi)皮素釋放，使血管內(nèi)皮舒張，緩解血管痙攣〔18〕。而增加催化活性的eNOS的表達(dá)，已成為預(yù)防和控制腦血管痙攣的主要途徑之一〔12〕。PI3K可激活A(yù)kt，活化的Akt可使鈣調(diào)節(jié)蛋白(CaM)結(jié)合的eNOS Thr49 殘基去磷酸化，并激活eNOS，從而改善血管內(nèi)皮舒張，并改善微循環(huán)〔19〕。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路和eNOS蛋白可介導(dǎo)腦組織血管內(nèi)皮舒張、改善微循環(huán)，并參與SAH患者腦保護(hù)及神經(jīng)保護(hù)作用。趙雅寧等〔20〕發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素受體拮抗劑通過上調(diào)PI3K、Akt基因表達(dá)，保護(hù)SAH大鼠早后期腦損傷；金珂等〔21〕發(fā)現(xiàn)丙酮酸乙酯可通過上調(diào)p-PI3K、p-Akt表達(dá)，緩解SAH大鼠腦血管痙攣；Xie等〔22〕發(fā)現(xiàn)Exendin-4可通過激活GLP-1R/PI3K/Akt通路表達(dá)，抑制SHA后早期神經(jīng)元凋亡、改善腦損傷。本研究結(jié)果提示Luteolin可能通過激活PI3K/Akt通路，增加eNOS含量，進(jìn)而改善血管痙攣，改善SAH大鼠腦損傷。

綜上，Luteolin可能通過激活PI3K/Akt通路，改善微循環(huán)障礙和血管痙攣，減少腦神經(jīng)元變性和死亡，改善SAH大鼠腦損傷。為臨床治療SAH提供一定的參考。但本研究未設(shè)置通路抑制劑進(jìn)行研究，有待后續(xù)繼續(xù)研究。