黎軼 王景振 劉瑞蓮 (宜春學(xué)院體育學(xué)院，江西 宜春 336000)

血管性癡呆(VD)是由一系列腦血管病變導(dǎo)致的腦組織損害引起的以認(rèn)知功能障礙為特征的綜合性癡呆疾病〔1〕，由于腦血管因素如缺血性腦卒中、出血性腦卒中導(dǎo)致的腦組織損傷，進(jìn)而損害相應(yīng)部位的神經(jīng)元，影響腦組織中的病理及生理變化，造成記憶力、認(rèn)知能力和行為習(xí)慣等方面出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙〔2,3〕。VD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明，從國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道來(lái)看，尚缺乏對(duì)控制本疾病進(jìn)程的理想防治方法。而現(xiàn)有的VD治療主要集中于腦卒中的預(yù)防、認(rèn)知功能的改善及行為控制和精神癥狀、血管擴(kuò)張和腦血流量改善、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)減輕及對(duì)腦血管和神經(jīng)的保護(hù)等〔4〕；藥物的使用也主要傾向于神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)劑、腦循環(huán)改善藥物、自由基清除劑等。從對(duì)VD的發(fā)病機(jī)制方面的研究來(lái)看，其發(fā)病可能與以下因素有關(guān)：中樞膽堿能系統(tǒng)功能障礙、中樞RNA和蛋白質(zhì)合成減少、局部炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷及機(jī)體免疫異常等〔5,6〕。白藜蘆醇最早發(fā)現(xiàn)于法國(guó)的紅葡萄酒，相關(guān)研究表明，紅葡萄酒所具有的保護(hù)血管、預(yù)防冠心病的主要作用來(lái)源于白藜蘆醇，近年來(lái)的研究也顯示，白藜蘆醇具有顯著的抗炎〔7〕、抗氧化和抗血小板凝集等作用〔8,9〕。本研究旨在探討有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合白藜蘆醇通過(guò)核因子E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2/ARE)信號(hào)通路抗VD大鼠海馬氧化損傷。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性12～14月齡SD大鼠，體重280～350 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)齒啃類飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由飲食，無(wú)異常，用Morris水迷宮篩選出較靈活的大鼠84只，隨機(jī)分為空白對(duì)照(C)組、空白對(duì)照運(yùn)動(dòng)(CE)組、VD模型(VD)組、VD模型運(yùn)動(dòng)(VE)組、白藜蘆醇對(duì)照(R)組、白藜蘆醇干預(yù)(RV)組、運(yùn)動(dòng)干預(yù)組和白藜蘆醇聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)(RE)組，每組12只，其中除對(duì)照組外的其他組大鼠進(jìn)行VD造模。

1.2研究方法

1.2.1VD模型的構(gòu)建 大鼠術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。參照相關(guān)文獻(xiàn)，用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定，消毒剃毛后，頸正中切口，縱向切開(kāi)皮膚及皮下組織，玻璃分針避開(kāi)迷走神經(jīng)分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以4號(hào)手術(shù)線，拉緊絲線扣，阻斷血流30 min，觀察到大鼠心跳加快，呼吸深慢即松開(kāi)絲線扣恢復(fù)血流10 min后，再次阻斷血流30 min，反復(fù)3次后，雙重絲線結(jié)扎，術(shù)中注意確保大鼠體溫，術(shù)后送至通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備的SPF動(dòng)物房飼養(yǎng)。對(duì)照組大鼠除不結(jié)扎頸總動(dòng)脈外，麻醉及手術(shù)過(guò)程均與模型組相同。術(shù)后7 d進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，依據(jù)超出對(duì)照組大鼠游至平臺(tái)平均時(shí)間的95%上限值的標(biāo)準(zhǔn)的模型組大鼠選定為VD大鼠。白藜蘆醇治療組于術(shù)后第4周開(kāi)始給予白藜蘆醇治療〔25 mg/(kg·d)，白藜蘆醇溶解于2 ml 0.5 g/L羧甲基纖維素鈉〕灌胃，連續(xù)進(jìn)行4 w。

1.2.2有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)模式 運(yùn)動(dòng)組大鼠借鑒Bedford等〔10〕運(yùn)動(dòng)方案和最大攝氧量(VO2max)百分?jǐn)?shù)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改良，坡度為10°、速度為16 m/min(約為65%VO2max強(qiáng)度)的動(dòng)物跑臺(tái)持續(xù)訓(xùn)練8 w，1次/d，60 min/次，6 d/w。

1.2.3神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定 采用中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制的Morris水迷宮測(cè)定系統(tǒng)記錄大鼠定點(diǎn)巡航和空間探索能力，攝像頭自動(dòng)記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡、計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)分析其游泳距離、平臺(tái)潛伏期，并計(jì)算不同象限中的游泳時(shí)間比例、距離比例等。

1.2.4海馬組織取材 最后一次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)大鼠禁食過(guò)夜，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，每組隨機(jī)篩選6只進(jìn)行腦在體固定，即嚴(yán)格按照開(kāi)胸，自心尖處將灌注針插入主動(dòng)脈后，先用4℃生理鹽水快速?zèng)_洗，再用4℃的預(yù)冷的4%多聚甲醛灌注，待大鼠前肢及頸背部僵硬，肝組織等臟器變白而硬后，灌注結(jié)束；冰上固定后自枕骨大孔處橫斷，斜向插入剪刀剪開(kāi)頂骨，止血鉗掰斷兩邊頂骨，剝離整個(gè)頂層顱骨，暴露整個(gè)腦組織，眼科剪分離顱底組織，將整塊腦組織翹起，置于4%多聚甲醛4℃保存48 h及以上。每組其余6只大鼠麻醉后，俯臥位固定，用上述方法剝離顱骨，暴露腦組織，眼科鑷翻開(kāi)大腦皮層，玻璃分針剝離海馬周邊組織，取下海馬組織，濾紙吸干組織液稱重后，正中分開(kāi)，左側(cè)海馬組織用于檢測(cè)蛋白成分，右側(cè)海馬組織保存于Trizol溶液中，-80℃凍存，用于核酸提取。

1.2.5大鼠海馬組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)活性檢測(cè) 冰上稱重后的海馬組織加入預(yù)冷的生理鹽水，玻璃勻漿器冰水浴中勻漿海馬組織，定量Biorad蛋白。嚴(yán)格按照MDA、SOD和GSH試劑盒說(shuō)明書，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA、氮藍(lán)四唑(NBT)法檢測(cè)SOD活性、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定GSH蛋白含量。

1.2.6大鼠海馬組織免疫組化檢測(cè) 固定完成的大鼠腦組織，脫水，冠狀面超前包埋、切片；常規(guī)脫蠟、復(fù)水，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，蒸餾水浸泡，PBS沖洗3次，滴加抗原修復(fù)液，PBS洗滌3次，滴加過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育30 min，滴加Nrf2多克隆抗體(1∶50，美國(guó)Santa Cruz)，4℃過(guò)夜；次日PBS洗滌，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加鏈霉菌抗生素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，滴加中性樹膠封片。每只大鼠相同視野下隨機(jī)取5張切片(×400)，應(yīng)用Image Pro Plus-6圖像分析軟件分析每組切片積分吸光度IA值。

1.2.7海馬組織總RNA提取 采用Total RNA提取試劑盒提取海馬組織總RNA。于超低溫冰箱取出存有海馬組織的Trizol試管，置于玻璃勻漿機(jī)中，冰中充分研磨，室溫裂解3 min，加入0.2體積的三氯甲烷，充分振蕩，12 000 r/min，15 min離心，取上清加入同體積的異丙醇，-20℃靜置20 min。12 000 r/min，15 min離心，棄上清，在沉淀中加入1 ml RNase-Free配制的75%乙醇，振蕩器振蕩。12 000 r/min，15 min離心，棄上清，無(wú)菌空氣中干燥10 min。加入50 μl RAase-Free水溶解沉淀。完全溶解后，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260 nm與OD280 nm值，判定其濃度和純度。

1.2.8RT-PCR檢測(cè)海馬組織Nrf2、SOD表達(dá)水平 提取的海馬組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由上海生物工程有限公司合成。引物合成序列：Nrf2：上游引物：5′-TTGGCAGAGACATTCCCATTTGTA-3′、下游引物：5′-ATCAGTCATGGCCGTCTCCAG-3′，215 bp；SOD-1：上游引物：5′-AATGTGTCCATTGAAGATCGTGTGA-3′、下游引物：5′-GCTTCCAGCATTTCCAGTCTTTGTA-3′，375 bp；HO-1：上游引物：5′-AGGTGCACATCCGTGCAGAG-3′、下游引物：5′-TCCAGGGCCGTATAGATATGGTACA-3′，339 bp；GAPDH：上游引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGA ATG-3′、下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，452 bp。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)延伸末收集熒光信號(hào)，繪制擴(kuò)增曲線，并對(duì)Nrf2、血紅素氧合酶(HO)-1、SOD等目的基因相對(duì)定量進(jìn)行分析，2-ΔΔCt計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量〔11〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合白藜蘆醇干預(yù)VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)果 與C組相比，VD組、VE組、RV組和RE組第1周訓(xùn)練的平均平臺(tái)潛伏期時(shí)間和上臺(tái)前游泳距離顯著升高(P<0.05)，但四組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，第5周VE、RV與RE組的平均平臺(tái)潛伏期時(shí)間和上臺(tái)前游泳距離均顯著低于VD組(P<0.01，P<0.05)；第8周的測(cè)試結(jié)果顯示，與VD組比較，VE、RV與RE組平均平臺(tái)潛伏期時(shí)間和上臺(tái)前游泳距離均顯著降低(P<0.01)，且以RE組改善趨勢(shì)最大，見(jiàn)表1。

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與VD組相比，VE與RV組大鼠在平臺(tái)撤去后所在象限中的潛伏期比例和游泳距離比例明顯增加(P<0.05)；RE組大鼠呈非常顯著性增加(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2免疫組化檢測(cè)結(jié)果與分析 免疫組化染色顯示，C組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中Nrf2核表達(dá)較少，而VD組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞可見(jiàn)大量Nrf2核著色的陽(yáng)性細(xì)胞；與C組(6.63±1.32)相比，VD組IA顯著增加(23.77±6.61，P<0.01)，與VD組相比，RV組(17.96±6.33)、VE組(13.29±4.74)、RE組海馬神經(jīng)細(xì)胞NRf2核著色的IA表達(dá)(8.45±3.50)顯著減少(P<0.05,P<0.01)，且明顯接近于R組(7.90±2.55)和CE組(5.47±2.09)。見(jiàn)圖1。

表1 白藜蘆醇聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)VD大鼠定位巡航、空間探索的效果比較

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Nrf2表達(dá)水平(免疫組化染色，×400)

2.3MDA、SOD和GSH活性比較 VD組大鼠海馬組織內(nèi)MDA活性較C組明顯升高，但SOD與GSH活性明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)；與VD組比較，RV與VE、RE組MDA活性明顯降低，SOD與GSH活性顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 白藜蘆醇聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)VD大鼠海馬組織 MDA、SOD與GSH活性的效果

2.4白藜蘆醇聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)VD大鼠海馬組織Nrf2、HO及SOD檢測(cè)結(jié)果與分析 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，VD組大鼠海馬組織內(nèi)Nrf2 mRNA的表達(dá)較C組顯著上調(diào)(P<0.05)；CE組Nrf2、HO-1、SOD mRNA較C組顯著上調(diào)(P<0.01)；與VD組相比，VE、RV、RE組大鼠海馬組織的Nrf2、HO-1、SOD mRNA均呈顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 白藜蘆醇聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)VD大鼠 海馬組織基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

本研究結(jié)果提示有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合白藜蘆醇能夠有效改善VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力。

氧化應(yīng)激損傷與VD發(fā)病具有高度的相關(guān)性，這可能與因氧化應(yīng)激導(dǎo)致體內(nèi)OFR沉積，進(jìn)而誘導(dǎo)海馬組織損傷，誘發(fā)VD，尤其是表現(xiàn)在氧化還原產(chǎn)物MDA、GSH與SOD在機(jī)體內(nèi)所反映的氧化還原狀態(tài)呈密切相關(guān)〔12〕。作為體內(nèi)氧自由基水平的標(biāo)志產(chǎn)物，MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，含量高低直接反應(yīng)機(jī)體氧化損傷程度〔13〕。SOD可通過(guò)水化而歧化O2-，在清除機(jī)體氧自由基的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，切斷自由基連鎖效應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，其活性與機(jī)體清除自由基的能力相關(guān)〔14〕。GSH廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，其可通過(guò)特異性催化穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，確保細(xì)胞的正常生理功能〔15〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，有氧運(yùn)動(dòng)雖然可以提高VD大鼠海馬組織抗氧化能力，但效果不如白藜蘆醇。

作為氧化應(yīng)激感受器的Nrf2〔16〕，是堿性亮氨酸拉鏈家族中調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)活性最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子〔17,18〕。Nrf2/ARE是近年來(lái)最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路，該通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，保護(hù)細(xì)胞組織氧化應(yīng)激損傷〔19〕。ARE負(fù)責(zé)調(diào)控多種抗氧化酶基因的額表達(dá)，以抵抗各種內(nèi)外源性氧化刺激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激性損傷，促進(jìn)氧自由基的平衡恢復(fù)〔20,21〕。本研究結(jié)果提示，白藜蘆醇和有氧運(yùn)動(dòng)均可降低Nrf2免疫組化切片積分吸光度IA值，且聯(lián)合干預(yù)組的影響最大。有氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)減少機(jī)體氧自由基的產(chǎn)生，增加其代謝，提高機(jī)體抗氧化能力，延緩大腦衰老，對(duì)VD有積極的防治作用〔22,23〕，但針對(duì)有氧運(yùn)動(dòng)防治VD的氧化應(yīng)激性損傷是否通過(guò)Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，鮮有報(bào)道。本研究進(jìn)一步證實(shí)，白藜蘆醇聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)可增加Nrf2及其下游抗氧化酶的表達(dá)，降低海馬組織MDA水平，增加SOD、GSH含量，減輕氧化應(yīng)激損傷，逆轉(zhuǎn)由VD誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激性海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷。