蔡瑜 燕普 常小偉 李武軍 汪海平

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，陜西 西安 710077；2安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

肝細(xì)胞癌(HCC)是常見的原發(fā)性肝癌，也是全球范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)導(dǎo)致死亡的最常見原因之一〔1〕。乙型肝炎病毒(HBV)感染，慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染、酗酒、黃曲霉毒素B1攝入和代謝綜合征都是導(dǎo)致HCC的高危因素。HBV感染發(fā)生率在亞洲最高〔2〕。慢性HBV感染仍無(wú)法治愈〔3〕。盡管HCC治療取得了巨大進(jìn)展，但仍缺乏有效治療HCC的措施〔4〕。正如在許多其他癌癥中觀察到的那樣，HCC腫瘤發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，包括關(guān)鍵生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因的遺傳和表觀遺傳轉(zhuǎn)化〔5〕。因此，需要清楚地闡明HCC發(fā)生的分子機(jī)制，并為HCC患者的早期診斷和治療開發(fā)新的策略。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是長(zhǎng)度大于200 bp的轉(zhuǎn)錄本，沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼功能〔6〕，代表一類非編碼RNA，在研究中受到的關(guān)注較少。研究表明，LncRNA對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)和翻譯控制的調(diào)控至關(guān)重要〔7，8〕。有證據(jù)表明，LncRNAs可能在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)關(guān)鍵的癌癥途徑〔9〕。有報(bào)道稱，人類LncRNA的數(shù)量可與蛋白質(zhì)編碼基因的數(shù)量相匹敵〔10〕，但只有少數(shù)LncRNA被研究。在過(guò)去的幾年中，由于各種新方法的成功應(yīng)用，包括全基因組范圍內(nèi)的基因表達(dá)篩選，全基因組范圍內(nèi)的關(guān)聯(lián)研究，區(qū)域性關(guān)聯(lián)分析和常規(guī)連鎖篩選，設(shè)計(jì)的LncRNA陣列，RIP-RNA測(cè)序，轉(zhuǎn)基因表達(dá)及基因敲除，LncRNA在癌癥中的功能正在日益被發(fā)掘。已鑒定出多種LncRNA在組織癌變、侵襲和轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要〔11～15〕。本研究前期通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TRIM52-AS1在HCC中高表達(dá)且與臨床預(yù)后有顯著相關(guān)性，然其在HCC中的作用研究尚不明確，本研究探討TRIM52-AS1在HCC發(fā)展進(jìn)程中的重要作用。

1 材料與方法

1.1研究組織及細(xì)胞培養(yǎng) 人HCC細(xì)胞HepG2購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并加入100 μg/ml鏈霉素和100 IU/ml青霉素；細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于含 5%CO2和 95%濕度的37℃培養(yǎng)箱中。另選取2019年4～7月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的30例HCC患者癌組織及癌旁正常組織樣本，均由術(shù)中獲取經(jīng)病理確認(rèn)后制成石蠟組織標(biāo)本，低溫液氮留存。

1.2臨床數(shù)據(jù)篩選 在臨床數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA〔16〕中，通過(guò)腫瘤組織/正常組織>2找到在HCC高表達(dá)的基因，通過(guò)進(jìn)一步分析，篩選出在HCC中有臨床意義的LncRNA。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/)設(shè)計(jì)特異性qPCR引物；cDNA用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛龋凑誵PCR mix 5 μl，primer 1 μl，cDNA 4 μl的配方加入96孔PCR板中；貼膜，以2 500 r/min離心1 min，將樣品放入qPCR儀器中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)完成后，拷貝數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：以6孔板轉(zhuǎn)染siRNA為例，將1 μl siRNA與250 μl Opti-MEM混勻，1 μl lipo2000與250 μl Opti-MEM混勻，室溫放置5 min，然后將兩部分合并，混勻，靜置15 min，之后逐滴、均勻加入6孔板中的1個(gè)孔中。

分組：HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染TRIM52-AS1無(wú)意義序列siCTL記為敲低TRIM52-AS1表達(dá)檢測(cè)的對(duì)照組(siCTL組)，轉(zhuǎn)染2條干擾siRNA序列分別記為TRIM52-AS1表達(dá)敲低siTRIM52-AS1#1組和siTRIM52-AS1#2組；轉(zhuǎn)染miR-562 mimic模擬物記為miR-562過(guò)表達(dá)組(miR-562組)，轉(zhuǎn)染miR-562-NC記為陰性對(duì)照組(NC組)；轉(zhuǎn)染miR-562反義核酸ASO記為敲低miR-562表達(dá)組(miR-562-ASO組)，轉(zhuǎn)染NC-ASO記為陰性對(duì)照組(NC-ASO組)；miR-562-ASO組中共轉(zhuǎn)染無(wú)意義siCTL序列記為miR-562-ASO+siCTL組，miR-562-ASO組中共轉(zhuǎn)染干擾siTRIM52-AS1序列記為miR-562-ASO+siTRIM52-AS1組。

1.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 消化長(zhǎng)滿10 cm盤的細(xì)胞，重懸于1 ml新鮮培養(yǎng)基中，用20 μl可鋪1個(gè)96孔板的密度鋪細(xì)胞，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需3個(gè)生物重復(fù)，鋪好所需的實(shí)驗(yàn)孔數(shù)。在5%CO2，37℃條件下孵育。細(xì)胞貼壁后即可轉(zhuǎn)染siRNA。48 h后開始測(cè)量吸光度。配制MTS反應(yīng)液，按照MTS：培養(yǎng)液=1∶20的比例配制反應(yīng)液。每孔加入100 μl MTS反應(yīng)溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。每隔30 min檢測(cè)1次吸光度。將培養(yǎng)皿置搖床上低速振蕩10 s以充分溶解結(jié)晶物。在490 nm處測(cè)量各孔的吸光值(OD值)。將每天的吸光值轉(zhuǎn)換成代表每日細(xì)胞生長(zhǎng)的參數(shù)，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6克隆形成實(shí)驗(yàn) 以6孔板細(xì)胞為例：每孔鋪2 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后即可轉(zhuǎn)染siRNA。每個(gè)樣品做3個(gè)生物重復(fù)，待6～14 d后出現(xiàn)肉眼可見克隆，收集細(xì)胞，用常溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用甲醇、乙酸比為3∶1的固定液常溫固定5 min，用含0.5%結(jié)晶紫的甲醇溶液常溫固定15 min，水洗，直至背景紫色洗掉，室溫晾干進(jìn)行掃描，用10%醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，并在OD590 nm測(cè)吸光度，繪制數(shù)據(jù)柱狀圖。

1.7劃痕遷移實(shí)驗(yàn) 10 cm盤的1/4鋪整個(gè)6孔板，待細(xì)胞貼壁后分別轉(zhuǎn)染siRNA，待細(xì)胞長(zhǎng)到90%用槍頭在盤中央劃痕，并用PBS洗1遍，拍攝0 h圖片作為對(duì)照，24 h后拍攝實(shí)驗(yàn)組照片。

1.8LncRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè) 通過(guò)網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)LncRNA結(jié)合的microRNA及具體位點(diǎn)，從而進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將HCC細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板中，使其密度為90%。含有海腎熒光素酶的報(bào)道質(zhì)粒被用作標(biāo)準(zhǔn)參考。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中。使用雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定系統(tǒng)(普洛麥格，北京，中國(guó))測(cè)量熒光素酶活性，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明將其轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)海腎熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該測(cè)定一式三份進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、K-M生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1篩選HCC中具有臨床意義的靶基因 研究首先通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出在HCC中相比鄰近正常組織顯著高表達(dá)的基因(腫瘤組織/正常組織>2)共1 315個(gè)，其中mRNA 1 284個(gè)，LncRNA 19個(gè)，misc_RNA 12個(gè)。研究主要關(guān)注LncRNA功能，因此將LncRNA按照表達(dá)差異進(jìn)行排序，同時(shí)結(jié)合高表達(dá)預(yù)后差原則，篩選出關(guān)鍵基因TRIM52-AS1(圖1)。

2.2TRIM52-AS1在HCC中的表達(dá)特征 研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)探究TRIM52-AS1在HCC中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)369例HCC組織中TRIM52-AS1表達(dá)顯著高于160例正常組織(3.32±0.53 vs 2.13±0.41，t=25.302，P<0.001)，同時(shí)具有明顯的TRIM52-AS1高表達(dá)預(yù)后差臨床特征(HR=1.5，P=0.047，圖2)；在30組HCC組織中TRIM52-AS1表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(26.12±4.36 vs 20.01±2.04，t=6.952，P<0.001)，說(shuō)明TRIM52-AS1在HCC發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

TPM：每百萬(wàn)單位的轉(zhuǎn)錄數(shù)圖1 將篩選出的HCC中高表達(dá)的LncRNA按表達(dá) 差異倍數(shù)利用熱圖進(jìn)行排序

TPM：每萬(wàn)單位的轉(zhuǎn)錄數(shù)圖2 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TRIM52-AS1表達(dá)與 HCC臨床預(yù)后相關(guān)性

2.3敲低TRIM52-AS1表達(dá)顯著抑制HCC細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移速率 siTRIM52-AS1#1組(0.23±0.04)和siTRIM52-AS1#2組(0.24±0.03)細(xì)胞中TRIM52-AS1相對(duì)表達(dá)均明顯低于siCTL對(duì)照組(1.01±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=621.414，P<0.001)，表明敲低TRIM52-AS1表達(dá)轉(zhuǎn)染成功。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，敲低TRIM52-AS1表達(dá)后HCC細(xì)胞增殖速率、克隆形成速率及劃痕遷移速率均顯著減慢(P<0.05，圖3、表1、圖4)。初步證明TRIM52-AS1在HCC中的重要作用。

圖3 敲低TRIM52-AS1表達(dá)后HCC細(xì)胞克隆形成速率變化

表1 敲低TRIM52-AS1對(duì)HCC細(xì)胞增殖OD值、克隆形成速率及劃痕遷移速率的影響

圖4 敲低TRIM52-AS1表達(dá)后HCC 細(xì)胞遷移速率變化(×100)

2.4miR-562可與TRIM52-AS1結(jié)合并負(fù)向調(diào)控其表達(dá) TRIM52-AS1與miR-562存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5)；通過(guò)將TRIM52-AS1野生型和突變型熒光質(zhì)粒與miR-562過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-562組TRIM52-AS1野生型熒光素酶活性明顯降低(P<0.001)，而對(duì)TRIM52-AS1突變型熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)，說(shuō)明TRIM52-AS1與miR-562靶向結(jié)合。與NC組比較，過(guò)表達(dá)miR-562細(xì)胞中，TRIM52-AS1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05,表2)。表明miR-562是TRIM52-AS1的靶基因，miR-562過(guò)表達(dá)可顯著抑制TRIM52-AS1表達(dá)。

2.5miR-562在HCC中的表達(dá)特征，其高表達(dá)可顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖 研究miR-562在HCC中的特征，發(fā)現(xiàn)30組HCC臨床樣本中miR-562表達(dá)顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織(20.05±2.34 vs 29.53±3.54，t=12.236，P<0.001)，并有明顯的低表達(dá)預(yù)后差臨床特征(HR=0.53，Log-rankP=0.026)，且與TRIM52-AS1在HCC中的表達(dá)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.572，P=0.000，圖6)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-562-ASO敲低組HCC細(xì)胞增殖速率顯著高于NC-ASO對(duì)照組(0.82±0.06 vs 0.45±0.03，t=9.553，P<0.001)，由此證實(shí)miR-562在HCC中與TRIM52-AS1存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系。

圖5 網(wǎng)站預(yù)測(cè)TRIM52-AS1的結(jié)合靶標(biāo)以及具體結(jié)合位點(diǎn)

表2 TRIM52-AS1與miR-562的結(jié)合及調(diào)控 關(guān)系驗(yàn)證

圖6 TRIM52-AS1與miR-562在30組臨床樣品中的 表達(dá)相關(guān)性

2.6miR-562調(diào)控TRIM52-AS1 在敲低miR-562表達(dá)的細(xì)胞中進(jìn)一步敲低TRIM52-AS1表達(dá)后，細(xì)胞增殖速率回歸到正常水平(表3)，表明miR-562通過(guò)調(diào)控TRIM52-AS1表達(dá)從而參與HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

表3 miR-562調(diào)控TRIM52-AS1對(duì)HCC細(xì)胞增殖OD值的影響

3 討 論

LncRNA是>200個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物，沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼功能。研究表明癌變的分子機(jī)制不僅與蛋白質(zhì)編碼基因有關(guān)，而且與非編碼調(diào)節(jié)性RNA有關(guān)〔17〕。研究表明，多種LncRNA在各種類型的實(shí)體瘤中均被失調(diào)，并且多個(gè)LncRNA可通過(guò)直接靶向染色質(zhì)修飾復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移，這表明LncRNA的異常表達(dá)增加了腫瘤發(fā)生和癌癥發(fā)展的機(jī)會(huì)〔18～20〕。例如，LncRNA HOTAIR過(guò)表達(dá)與乳腺癌有關(guān)〔21〕；MALAT1的上調(diào)與膀胱癌有關(guān)〔22〕；LncRNA XIST的下調(diào)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有關(guān)〔23〕；PCAT-1的上調(diào)與前列腺癌有關(guān)〔24〕。研究〔25〕主要探究了TRIM52-AS1在腎癌中的腫瘤抑制作用，與此作用相反的是，本研究發(fā)現(xiàn)TRIM52-AS1在HCC中扮演促癌基因角色。

本研究表明，敲低TRIM52-AS1導(dǎo)致HCC細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移速率顯著減慢說(shuō)明TRIM52-AS1在HCC發(fā)展進(jìn)程中的促癌作用。為進(jìn)一步探究TRIM52-AS1在HCC中發(fā)揮功能的作用方式，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，TRIM52-AS1可與miR-562結(jié)合，同時(shí)miR-562可顯著負(fù)調(diào)控其表達(dá)，而miR-562在HCC中的表達(dá)特征恰巧與TRIM52-AS1相反，miR-562在HCC中顯著低表達(dá)且具有明顯的低表達(dá)預(yù)后差的臨床相關(guān)性，敲低miR-562表達(dá)也可顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖，這些都顯示了TRIM52-AS1與miR-562的負(fù)相關(guān)性；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TRIM52-AS1促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖主要是由miR-562調(diào)控所致。

綜上，HCC中TRIM52-AS1高表達(dá)，敲低其表達(dá)能抑制HCC細(xì)胞的增殖、克隆形成和遷移，其發(fā)揮作用可能與miR-562低表達(dá)有關(guān)。