張霞 杜文澤 趙漢清 張碩

(河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院 1消化內(nèi)科 河北 張家口 075100；2超聲科；3中醫(yī)科；4手術(shù)室)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)病變主要局限于結(jié)腸黏膜及黏膜下層，多累及乙狀結(jié)腸、直腸，嚴(yán)重者可危及整個(gè)結(jié)腸，其病因復(fù)雜，涉及多種飲食、感染、環(huán)境等因素〔1，2〕。UC臨床上一般表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液性膿血便、里急后重，病理以結(jié)腸潰瘍糜爛為主，伴有連續(xù)性、淺表性、彌散性特點(diǎn)，病程長(zhǎng)，且易復(fù)發(fā)〔3，4〕。目前臨床上治療UC多采用生物制劑、免疫抑制劑、氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、抗生素等，療效不佳，副作用多，且復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量〔5〕。漢黃芩苷是黃芩的主要成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗氧化等藥理作用〔6，7〕。目前尚未有漢黃芩苷治療UC的相關(guān)報(bào)道，本研究構(gòu)建UC大鼠模型，考察不同劑量漢黃芩苷對(duì)UC大鼠癥狀緩解情況及對(duì)炎癥因子、氧化標(biāo)志物水平的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 漢黃芩苷(貨號(hào)：B20488，規(guī)格20 mg，純度≥98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；柳氮磺胺吡啶(SASP)腸溶片(國(guó)藥準(zhǔn)字H31020450，批號(hào)：20190106)購(gòu)自上海中西三維藥業(yè)有限公司；過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為A007-1-1、A005-1-2、A044-1-1、A001-1、A003-1；白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為E-EL-R0012c、E-EL-R0016c、E-EL-R0019c；XSP-9CA型生物顯微鏡購(gòu)自上海光學(xué)儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 雄性Wistar大鼠(SPF級(jí))購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，7周齡，體重220～250 g，許可證號(hào)：SYXK(粵)2018-0001。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后根據(jù)Morris等〔8〕方法建立UC大鼠模型：建模前均禁食禁水1 d，以4 mg/100 g劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉以麻醉大鼠，用14號(hào)導(dǎo)尿管(直徑2 mm、長(zhǎng)15 cm)一次性將2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS,100 mg/kg)和0.25 ml乙醇溶液緩緩注入距大鼠肛門約8 cm深的腸腔內(nèi)，注入完成后捏緊肛門，并倒置5 min，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(該組大鼠采用同樣方法注入等體積的生理鹽水)；將UC模型大鼠分為UC模型組；SASP組(0.67 g/kg)〔9〕；低劑量漢黃芩苷(25 mg/kg)組；中劑量漢黃芩苷(50 mg/kg)組；高劑量漢黃芩苷(100 mg/kg)組〔10〕，每組10只。造模后第2天開始以2 ml給藥體積灌胃給藥，對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.3各組大鼠一般情況 治療期間觀察各組狀態(tài)及大便情況，根據(jù)疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Arab等〔11〕所描述的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：體重減少<1%：大便正常，潛血陰性；1分，體重減少≥1%且<5%；2分：體重減少≥5%且<10%，出現(xiàn)軟便，且潛血陽(yáng)性；3分：體重減少≥10%且<15%；4分：體重減少≥15%，出現(xiàn)溏便和肉眼可見的血便。

1.4樣本采集和保存 最后一次給藥24 h后，脫頸處死各組大鼠，沿腹部刨開，取出距肛門約8 cm處結(jié)腸，采用雙盲法肉眼觀察各組大鼠結(jié)腸病理?yè)p傷情況，記錄并參照Galvez等〔12〕所描述的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無損傷0分；充血但無潰瘍1分；1處線性潰瘍但是無明顯炎性反應(yīng)2分；1處線性潰瘍和炎性反應(yīng)3分；2處或多處潰瘍或炎性反應(yīng)，直徑<1 cm 4分；2處或以上潰瘍及炎性反應(yīng)，直徑>1 cm 5分。將結(jié)腸組織置于10%多聚甲醛固定，剩余結(jié)腸組織儲(chǔ)存于-80℃冰箱中待后續(xù)檢測(cè)。

1.5各組大鼠促炎因子、氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè) 從-80℃冰箱中取出結(jié)腸組織，加入適量緩沖液，4℃條件下勻漿，隨后離心取上清液進(jìn)行測(cè)定。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定結(jié)腸組織中IL-1β、IL-10、TNF-α水平；生化法檢測(cè)結(jié)腸組織中CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平，操作步驟均按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.6各組大鼠結(jié)腸組織蘇木素-伊紅(HE)染色 將固定好的各組大鼠結(jié)腸組織取出，置于生物脫水機(jī)行逐級(jí)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度約4 μm)，行常規(guī)HE染色，封片后用光鏡觀察各組結(jié)腸組織病理變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，兩組比較行SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況比較 大鼠造模24 h后可見黏液性稀便，部分可見便血，毛發(fā)無光澤、精神萎靡、飲食減少、懶動(dòng)，說明UC模型大鼠構(gòu)建成功。經(jīng)治療后，低、中劑量漢黃芩苷組大鼠稀便及血便癥狀稍緩解，毛色略顯晦暗無光澤；高劑量漢黃芩苷組和SASP組稀便及血便癥狀明顯緩解，毛色恢復(fù)光亮。與對(duì)照組〔(0.00±0.00)分〕相比，UC模型組DAI評(píng)分顯著升高〔(9.41±0.92)分，P<0.05〕；經(jīng)漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，DAI評(píng)分依次降低〔(8.95±0.89)分、(7.93±0.82)分、(5.53±0.54)分，P<0.05〕；高劑量漢黃芩苷組DAI評(píng)分與SASP組〔(5.86±0.71)分〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組結(jié)腸組織宏觀損傷情況比較 肉眼可見UC模型組大鼠結(jié)腸潰瘍表淺多且大，黏膜嚴(yán)重糜爛；經(jīng)治療后，結(jié)腸潰瘍數(shù)量、面積減少，程度減輕，黏膜損傷情況有所緩解，且癥狀改善程度與漢黃芩苷劑量呈正相關(guān)。與對(duì)照組〔(0.00±0.00)分〕相比，UC模型組宏觀損傷評(píng)分顯著升高〔(4.52±0.61)分，P<0.05〕；經(jīng)漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，宏觀損傷評(píng)分依次明顯降低〔(4.02±0.44)分、(3.36±0.52)分、(2.51±0.27)分，P<0.05〕；高劑量漢黃芩苷組宏觀損傷評(píng)分與SASP組〔(2.72±0.34)分〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組結(jié)腸組織中IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平比較 與對(duì)照組相比，UC模型組、SASP組、漢黃芩苷各劑量組IL-1β、TNF-α、MPO、MDA水平顯著升高，IL-10、CAT、GSH-Px、SOD水平明顯降低(P<0.05)；經(jīng)漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，IL-1β、TNF-α、MPO、MDA水平依次明顯降低(P<0.05)，IL-10、CAT、GSH-Px、SOD水平依次明顯升高(P<0.05)；高劑量漢黃芩苷組IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平與SASP組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組結(jié)腸組織中IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平比較

2.4各組結(jié)腸組織HE染色結(jié)果比較 對(duì)照組結(jié)腸黏膜完整，未見炎癥損傷，肌層排列整齊，腺體結(jié)構(gòu)正常，未見充血；UC模型組結(jié)腸黏膜均有明顯炎癥損傷、變薄，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層結(jié)構(gòu)紊亂，腺體充血、水腫；經(jīng)漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，結(jié)腸黏膜、肌層、腺體病變損傷明顯緩解；高劑量漢黃芩苷組癥狀緩解情況與SASP組相當(dāng)。見圖1。

圖1 各組結(jié)腸組織HE染色(×200)

3 討 論

UC在中醫(yī)學(xué)上屬于“休息痢”“泄瀉”“痢疾”等范疇，該病機(jī)以血熱妄行、濕熱蘊(yùn)結(jié)大腸為主〔5〕。目前多認(rèn)為促炎因子和抑炎因子、氧化介質(zhì)和抗氧化介質(zhì)之間的平衡紊亂是其主要病因，而漢黃芩苷具有抗炎、抗氧化的藥理作用。

研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩苷能夠抑制Toll樣受體(TLR)4介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB炎癥信號(hào)通路活性，從而發(fā)揮抗炎作用，以緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷癥狀〔13〕。此外漢黃芩苷可抑制NOD樣受體蛋白3炎癥小體(NLRP3)和NF-κB活化以發(fā)揮抗炎作用，緩解3，3′-二甲氧基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀〔14〕。葉圣榮等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷能夠下調(diào)MDA水平，上調(diào)SOD、還原性谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮合酶(iNOS)水平以抑制腎缺血/再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)腎功能。本研究說明漢黃芩苷能夠緩解UC癥狀，對(duì)UC有一定的治療效果。行結(jié)腸組織宏觀損傷分析發(fā)現(xiàn)，UC模型組大鼠結(jié)腸潰瘍表淺多且大，黏膜嚴(yán)重糜爛；經(jīng)漢黃芩苷治療后，結(jié)腸潰瘍數(shù)量、面積減少，程度減輕，黏膜損傷情況有所緩解，隨著給藥劑量增高，宏觀損傷評(píng)分依次降低，說明漢黃芩苷能夠保護(hù)UC大鼠結(jié)腸組織，促進(jìn)黏膜修復(fù)。病理學(xué)HE染色結(jié)果同樣說明，經(jīng)漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，結(jié)腸黏膜、肌層、腺體病變損傷明顯緩解。炎癥因子異常表達(dá)與UC相關(guān)，UC活動(dòng)期大量單核-巨噬細(xì)胞聚集于結(jié)腸黏膜，合成并釋放大量IL-1β，引起結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致黏膜組織破壞〔16〕。IL-10作為抑炎因子，可抑制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子，維持正常腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)〔17〕。TNF-α主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)中，能夠使中性粒細(xì)胞聚集、發(fā)生呼吸爆發(fā)、脫顆粒等參與UC病程〔18〕。本研究結(jié)果說明，漢黃芩苷能夠下調(diào)促炎因子IL-1β、TNF-α水平，上調(diào)抑炎因子IL-10水平以抑制UC大鼠炎癥反應(yīng)。SOD可清除機(jī)體超氧化物陰離子，具有抗氧化作用，當(dāng)其含量降低時(shí)，導(dǎo)致自由基累積，MDA作為質(zhì)子過氧化物最終產(chǎn)物能夠間接反映氧化應(yīng)激程度，因此測(cè)定SOD、MDA水平可反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度〔19〕。CAT位于細(xì)胞的過氧化體中，作為抗氧化系統(tǒng)中酶系統(tǒng)的重要組成部分，能夠與SOD協(xié)同清除自由基，保護(hù)機(jī)體免受損害，可作為評(píng)價(jià)機(jī)體的抗氧化能力〔20〕。GSH-Px作為過氧化氫酶，在機(jī)體中分布廣泛，可保護(hù)細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)免受過氧化氫的氧化損傷〔21〕。MPO是由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過氧化物酶，一般分布在單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中，其水平可反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度〔22〕。本研究說明漢黃芩苷可調(diào)節(jié)氧化因子和抗氧化因子平衡，拮抗氧化應(yīng)激進(jìn)程。