宋思雨 丁露 李雅馨 王菁 魏萊 王子元 趙佳超 李香艷 王澤玉

(長春中醫(yī)藥大學(xué) 1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，吉林 長春 130117；2吉林省人參科學(xué)研究院;長春中醫(yī)藥大學(xué) 3附屬醫(yī)院肺病科；4中醫(yī)學(xué)院)

To explore the biological mechanism of Buyang Huanwu Decoction on idiopathic pulmonary fibrosis based on network pharmacology

SONG Si-Yu，DING Lu，LI Ya-Xin，etal.

College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China

【Abstract】ObjectiveTo predict the potential targets and possible mechanisms of the Buyang Huanwu decoction (BYHWT) for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) using a network pharmacology study, and to validate in vitro experiments by transforming growth factor (TGF)-β1-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) in alveolar epithelial cells A549.MethodsAccording to the principle of network pharmacology, the potential targets of BYHWT in the treatment of IPF were obtained.Cytoscape software drawing, STRING network platform and metascape database were used for protein interaction(PPI) network, gene ontology(GO) and kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) enrichment analysis.TGF-β1-induced alveolar epithelial cells were used as the in vitro model.Experimental validation of network pharmacological prediction signaling pathway was carried out.ResultsThe network pharmacology predicted 168 potential targets of BYHWT for the treatment of IPF, and the signaling pathways associated with KEGG enrichment analysis were PI3K/AKT signaling pathway, nuclear transcription factor(NF) -κB signaling pathway, and FOXO signaling pathway. Cell experiment results showed that compared with the model group, BYHWT could significantly down-regulate the protein levels of p-Akt1/2/3 and phosphorylated NF-κB inhibitor protein (p-IκBα), and the gene expressions of EMT-related marker proteins type Ⅰ collagen(Coll)A1, snail and vimentin were significantly down-regulated at RNA level(P<0.05).ConclusionsBYHWT has the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway to preventing and curing IPF, which plays a main role in the treatment of IPF by inhibiting the PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway.

【Keywords】 Network pharmacology；Buyang Huanwu decoction；Idiopathic pulmonary fibrosis；Epithelial-mesenchymal transition；PI3K/AKT/NF-κB

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)是由不明原因引起的一種慢性、進(jìn)行性、間質(zhì)性的肺疾病〔1〕。該病的發(fā)病率和死亡率較高，目前仍缺乏有效的治療手段〔2,3〕。盡管IPF的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，但大量證據(jù)表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生是導(dǎo)致IPF的主要原因之一〔4,5〕。EMT的典型特征為α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、鋅指蛋白(Snail)、波形蛋白(Vimentin)上調(diào)〔1，6，7〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是纖維化疾病中最有效的誘導(dǎo)劑之一，肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激后能夠向EMT轉(zhuǎn)化〔8〕。

IPF在中醫(yī)歸屬于“肺痿”“肺痹”等范疇，發(fā)病過程中“淤血”始終貫穿其中〔9〕。補(bǔ)陽還五湯(BYHWT)是益氣活血的代表方，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其對IPF的治療有較好的效果。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，BYHWT調(diào)控炎癥因子的釋放，抑制成纖維細(xì)胞增殖，干預(yù)EMT進(jìn)程等〔10〕。但關(guān)于多成分多靶點(diǎn)的BYHWT治療IPF具體機(jī)制的報(bào)道尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選BYHWT治療IPF的潛在靶點(diǎn)和通路，并探討該方對A549人源肺泡上皮細(xì)胞的EMT作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞 A549人源肺泡上皮細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。藥品與試劑：BYHWT藥物組成為黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)〔11〕。RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma，美國)；胎牛血清(Clark，美國)；胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、磷酸緩沖鹽溶液(BI，以色列)；TGF-β1(MCE，美國)；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(Roche，瑞士)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天)；p-Akt1/2/3、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα；Santa Cruz，美國)；SMA(CST，美國)；微管蛋白(Tubulin)(Proteintech，美國)二抗：羊抗兔、羊抗小鼠(Proteintech，美國)；總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(天根)PCR引物(生工)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱(Esco，新加坡)；蛋白電泳儀、濕式轉(zhuǎn)印槽、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-red，美國)；倒置顯微鏡(Nikon，日本)；離心機(jī)(Eppendorf，德國)。

1.3BYHWT成分及靶點(diǎn)篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫，設(shè)置篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18和TCMID數(shù)據(jù)庫收集BYHWT中黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、紅花、地龍和桃仁的化學(xué)成分及相應(yīng)的靶點(diǎn)，結(jié)合Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，并將以上所獲得靶點(diǎn)提交Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫，獲得相應(yīng)的人源基因靶點(diǎn)的名稱。

1.4IPF差異性表達(dá)基因的收集 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索IPF相關(guān)靶標(biāo)與1.3所收集的靶點(diǎn)取交集對比，最終得到BYHWT治療IPF的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在線網(wǎng)站STRING上傳1.4得交集結(jié)果，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，最低互作分?jǐn)?shù)為“Medium confidence(0.400)”，其余參數(shù)選擇為默認(rèn)值。

1.6核心靶點(diǎn)的京都基因與基因組百科全書(KEGG)與基因本體(GO)富集分析 設(shè)置條件 “Input as species：Homo sapiens，P<0.01”，在Metascape網(wǎng)站輸入1.4交集靶點(diǎn)得到的Gene Symbol進(jìn)行KEGG、生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)富集分析。

1.7BYHWT抗IPF體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.7.1BYHWT的制備 中藥水煎液，將其過濾、離心取上清。經(jīng)濃縮后，于真空干燥機(jī)中60℃烘干成粉末。使用時(shí)間，取10 mg復(fù)方粉末溶于10 ml PBS中，配制為1 mg/ml儲備液。經(jīng)0.22 μm濾膜后，置于4℃保存。

1.7.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù) A549細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液)。培養(yǎng)條件為：37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱。設(shè)置對照組：完全培養(yǎng)基；模型組：5 ng/ml TGF-β1；治療組：5 ng/ml TGF-β1，BYHWT：62.5 μg/ml，干預(yù)48 h〔11〕。

1.7.3Western印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 用放射免疫沉淀(RIPA)裂解緩沖液從A549細(xì)胞中提取總蛋白。運(yùn)用BCA法定量蛋白。在8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE,30 μg)進(jìn)行電泳分離各組樣本中的蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室溫環(huán)境下，用5%BSA-TBST溶液在搖床上封閉1 h。在4℃搖床中孵育一抗過夜。次日，用含0.05% Tween-20的TBS緩沖液在搖床上洗膜5次，5 min/次。室溫中孵育1 h二抗。洗膜同上。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒對條帶進(jìn)行顯色。使用以下一抗：p-Akt1/2/3(1∶500)，p-IκBα(1∶1 000)，α-SMA(1∶1 000)，Tubulin(1∶5 000)。

1.7.4qRT-PCR 收集細(xì)胞上清液，用PBS清洗兩遍。按總RNA提取試劑盒的說明書操作：加入裂解液350 μl和10 μl Proteinase K，吹打消化細(xì)胞至板底干凈。收集裂解液至1.5 ml離心管中至離心機(jī)中，以12 000 r/min、4℃離心5 min。取上清液加入基因組DNA去除柱中，12 000 r/min離心30 s，將所得濾液保留。將濾液中緩慢加入同等體積的70%乙醇，輕微混勻，轉(zhuǎn)入RNase-Free吸附柱CR4中，12 000 r/min離心30 s，棄收集管中的廢液。在CR4管中加入500 μl漂洗液RW，室溫置2 min，12 000 r/min離心60 s，棄去廢液，將CR4放回收集管中，重復(fù)兩次。12 000 r/min離心2 min，棄掉廢液。RNase-Free吸附柱CR4置于室溫2 min，轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的RNase-Free離心管中，加入30 μl RNase-Free ddH2O溶解RNA，室溫靜置2 min，再以12 000 r/min離心2 min，獲得RNA溶液。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR熒光定量試劑盒按試劑盒的流程操作。用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量計(jì)算。CollA1：上游引物：5′-TTCTGCAACATGGAGACTGG-3′，下游引物：5′-AATCCATCGGTCATGCTCTC-3′；Vimentin:上游引物：5′-GGACCAGCTAACCAACGACA-3′，下游引物：5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′;Snail:上游引物：5′-CTCGGACCTTCTCCCGAATG-3′；下游引物：5′-AAAGTCCTGTGGGGCTGATG-3′；GAPDH：上游引物：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行單因素方差分析、Tukey-Kramer檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BYHWT的有效成分及靶點(diǎn)預(yù)測 在TCMSP數(shù)據(jù)庫收集BYHWT有效成分,將其與TCMID與Swiss Target Prediction搜集地龍成分及靶點(diǎn)刪除重復(fù)值篩選出110個(gè)有效成分和348個(gè)靶點(diǎn)。

2.2BYHWT治療IPF潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測 依托GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得治療IPF潛在基因靶點(diǎn)3 054個(gè),將篩選條件設(shè)置為“Relevance score≥4.56”，剩余1 531個(gè)靶點(diǎn)。將BYHWT活性成分的靶點(diǎn)與IPF靶點(diǎn)相匹配，獲取潛在核心靶點(diǎn)168個(gè)。

2.3“疾病藥物交集靶點(diǎn)-成分圖”的網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape3.7.1作圖軟件構(gòu)建BYHWT有效成分關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，分析BYHWT治療IPF的機(jī)制。左側(cè)圈代表活性成分作用的靶點(diǎn)，右側(cè)圈代表活性成分(以Mol ID表示)，圈的大小代表度值(Degree)的高低。邊代表活性成分和靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。圖中一個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree值的含義是和該節(jié)點(diǎn)相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)目。如果這個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree較大，說明這個(gè)節(jié)點(diǎn)在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中是樞紐作用，表明此點(diǎn)是關(guān)鍵的靶點(diǎn)或者化合物，見圖1。

圖1 疾病藥物交集靶點(diǎn)-成分

2.4BYHWT治療IPF關(guān)鍵作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò) 將168個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，得到的PPI圖。圖中有節(jié)點(diǎn)168個(gè)、邊3 646條、平均節(jié)點(diǎn)數(shù)43.4，見圖2。

2.5核心靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG通路分析 在Metascape數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用GO和KEGG對168個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分析。取BP、CC、MF前20排名結(jié)果，見圖3。在BP中，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)、活性氧代謝過程、對傷害的反應(yīng)等排名靠前。在MF中，主要包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白域特異性結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等。在CC中，主要是膜筏、囊泡腔、細(xì)胞外基質(zhì)、液泡等。

KEGG信號通路分析顯示，癌癥通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中、麻疹、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、NF-κB 信號通路與168個(gè)核心靶點(diǎn)關(guān)系密切。

圖2 BYWHT治療IPF靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6TGF-β1對A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，對照組A549細(xì)胞48 h細(xì)胞的形態(tài)呈鵝卵石樣，細(xì)胞大小均勻，沒有突觸或多角，貼壁狀態(tài)良好。經(jīng)TGF-β1刺激后細(xì)胞形態(tài)向梭形改變，圓形度明顯降低，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，見圖4。

2.7BYHWT對EMT、PI3K/Akt/NF-κB標(biāo)志蛋白影響 根據(jù)預(yù)測靶點(diǎn)的KEGG通路的富集結(jié)果顯示，PI3K-Akt、NF-κB、FOXO信號通路排名靠前，對PI3K/Akt/NF-κB信號通路的標(biāo)志蛋白進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。與模型組相比，治療組下調(diào)EMT標(biāo)志蛋白α-SMA和PI3K/Akt/NF-κB信號通路標(biāo)志蛋白p-Akt1/2/3、p-IκBα水平，見表1。

圖3 BYHWT抗IPF的KEGG、GO分析

表1 BYHWT對TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞中α-SMA、 p-Akt1/2/3和p-IκBα蛋白表達(dá)的影響

2.8BYHWT對EMT相關(guān)mRNA影響 與對照組相比，TGF-β1促進(jìn)了CollA1、Vimentin、Snail的mRNA表達(dá)(P<0.05)。經(jīng)BYHWT干預(yù)后，Col1A1、Vimentin和Snail轉(zhuǎn)錄因子水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 BYHWT對TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞中CollA1、 Vimentin和Snail基因表達(dá)的影響

3 討 論

肺纖維化是一種慢性進(jìn)行性呼吸性肺疾病，具有快速導(dǎo)致呼吸衰竭和高死亡率的特點(diǎn)〔12〕。IPF是肺纖維化中最常見的形式〔13〕。BYHWT始載于清代王清任所撰《醫(yī)林改錯(cuò)》，方中重用黃芪補(bǔ)氣通絡(luò)，當(dāng)歸尾、川芎養(yǎng)血行氣不傷本，地龍善于通經(jīng)活絡(luò)，赤芍、桃仁、紅花助當(dāng)歸尾活血通絡(luò)，使氣旺血行以固本，散淤通絡(luò)以治標(biāo)，終得標(biāo)本兼治。研究〔14〕發(fā)現(xiàn)，BYHWT治療IPF的療效不僅優(yōu)于單純的西藥治療，還能夠改善患者的生活質(zhì)量。有研究表明，經(jīng)BYHWT干預(yù)后，IPF患者肺功能明顯高于治療前〔11〕。因此，BYHWT治療IPF的作用機(jī)制亟待研究。本研究結(jié)果證明，在經(jīng)BYHWT干預(yù)之后，A549人肺泡上皮細(xì)胞通過PI3K/Akt/NF-κB通路抑制EMT進(jìn)程，發(fā)揮抗纖維化的作用。

槲皮素是一種自然界中廣泛存在的黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槲皮素具有抗纖維化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用〔14〕。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠通過多種途徑發(fā)揮抗纖維化的作用〔15～17〕。木犀草素主要通過調(diào)控NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號軸抑制SiO2誘導(dǎo)的矽肺纖維化〔18〕。這些活性成分的生物學(xué)功能從一定程度上證明了預(yù)測結(jié)果的可靠性。在PPI核心靶點(diǎn)中，TNF、Akt1、IL-6均被報(bào)道過參與肺纖維化病程〔16〕，推測BYHWT可能通過調(diào)控以上靶點(diǎn)發(fā)揮抗纖維化的作用。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，共得到300條通路，其中相關(guān)度較高的通路為癌癥通路，與糖尿病相關(guān)AGE-RAGE信號通路，麻疹、PI3K-Akt信號通路、NF-κB和FOXO等信號通路相關(guān)。已有研究證明，抑制PI3K/Akt/mTOR或NF-κB信號通路能夠緩解肺纖維化〔17,18〕。

綜上，BYHWT通過降低p-Akt 1/2/3和p-IκBα的表達(dá)，抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路的激活和TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT的進(jìn)程。這為BYWHT在臨床應(yīng)用提供了可能。