杜光紅 余雪蓮 陳韻 張彤彤 蔡玉婷

(1四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072；2重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

Effects of AKT inhibitors on the physiological activity of colon cancer cells and β-catenin signal

DU Guang-Hong，YU Xue-Lian,CHEN Yun,etal.

Sichuan Academy of Medical Sciences.Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072, Sichuan，China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the effects of AKT inhibitors on the physiological activity of colon cancer cells and β-catenin signal.Methods5×103SW480 cells grown logarithmically were taken and added 0.0，2.5，5.0,10.0 μmol/L MK2206 to intervene for 24 h, and observe the morphology of SW480 cells with a microscope;CCK-8 test was used to determine survival rate;cloning experiment was used to detect the number of cell clones; Hoechst fluorescence staining was used to detect the apoptosis rate; the protein and mRNA expressions of β-catenin and p-AKT were detected by Western blot and PCR, respectively.ResultsThe SW480 cells treated with 2.5,5.0,10.0 μmol/L were significantly different from the 0.0 μmol/L concentration group (P<0.05), and the survival rate of SW480 cells treated with 5.0 μmol/L was lower than that of 2.5 μmol/L(P<0.05), the survival rate of SW480 under 10.0 μmol/L treatment was the lowest, and it was time-dose-dependent.The number of SW480 cell clones under 2.5 μmol/L treatment was less than that of 0.0 μmol/L concentration (t=3.080,P<0.05), and the number of 5.0 μmol/L cell clones was less than that of 2.5 μmol/L(t=5.385,P<0.05). The number of clones in 10.0 μmol/L SW480 cells was significantly less than that of 5.0 μmol/L group (t=13.96,P<0.05); the apoptosis rate of SW480 cells under 2.5 μmol/L treatment was significantly higher than that of 0.0 μmol/L concentration (t=13.220,P<0.05), 5.0 μmol/L cell apoptosis rate was higher than that of 2.5 μmol/L group(t=6.029,P<0.05), 10.0 μmol/L SW480 cell apoptosis rate was significantly higher than that of 5.0 μmol/L group (t=8.402,P<0.05). The β-catenin and p-AKT protein levels of SW480 cells treated with 2.5 μmol/L were significantly lower than those in the 0.0 μmol/L concentration(tβ-catenin=3.184,tp-AKT=3.060, bothP<0.05), the β-catenin and p-AKT protein levels of SW480 cells treated with 5.0 μmol/L were lower than those in the 2.5 μmol/L group (tβ-catenin=3.275,tp-AKT=8.227, bothP<0.05),the β-catenin and p-AKT protein levels of SW480 cells treated with 10.0 μmol/L were significantly lower than those in the 5.0 μmol/L group(tβ-catenin= 5.039,tp-AKT=5.477,P<0.05). The β-catenin and p-AKT mRNA in SW480 cells treated with 2.5 μmol/L were significantly lower than those in the 0.0 μmol/L concentration (tβ-catenin=4.756,tp-AKT=3.132, bothP<0.05), β-catenin and p-AKT mRNA in SW480 cells treated with 5.0 μmol/L were significantly lower than those in the 2.5 μmol/L group (tβ-catenin=8.227,tp-AKT=3.811, bothP<0.05), β-catenin and p-AKT mRNA in SW480 cells treated with 10.0 μmol/L were significantly lower than those in the 5.0 μmol/L group (tβ-catenin=9.959,tp-AKT=6.235,P<0.05 ).ConclusionsThe AKT inhibitor MK2206 could reduce the physiological activity of human colon cancer cell line SW480, reduce the survival rate, and inhibit the activation of β-catenin and p-AKT. The above indicators decrease with the increase of MK2206 concentration.

【Keywords】 Colon cancer; AKT inhibitor; MK2206; Cell morphology; Survival rate; β-catenin;p-AKT

結(jié)腸癌屬于消化系統(tǒng)高發(fā)病率惡性腫瘤。流行調(diào)查顯示：全球發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)腸癌發(fā)病率極高，我國(guó)結(jié)腸癌患者發(fā)病率占消化道惡性腫瘤的第3位，并呈逐漸升高趨勢(shì)〔1〕。結(jié)腸癌是多因素多環(huán)節(jié)導(dǎo)致，家族遺傳占結(jié)腸癌發(fā)生因素的20%，外界環(huán)境及飲食因素占80%。病理性研究表示，結(jié)腸癌病灶部位是直腸與乙狀結(jié)腸交界處惡性腫瘤細(xì)胞從表層組織向肌層浸潤(rùn)，逐漸累及淋巴結(jié)〔2〕。手術(shù)及放化療能治療結(jié)腸癌，50%患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡，因此了解結(jié)腸癌細(xì)胞遏制機(jī)制對(duì)于臨床治療具有重要幫助。β連環(huán)素(catenin)是Wnt作用調(diào)控因子，是分子量約9 295 kD的蛋白質(zhì)，有多個(gè)氨基酸殘基組成〔3〕。β-catenin在結(jié)腸癌中能夠通過(guò)聯(lián)合多因致癌因子發(fā)揮功能，加快腫瘤細(xì)胞分泌及增殖，疾病的發(fā)生發(fā)展與β-catenin信號(hào)異?；罨嚓P(guān)〔4〕。絲氨酸/蘇氨酸激酶(PKB)又稱(chēng)AKT蛋白，包含多個(gè)下游因子，例如AKT1、AKT2等，均是PI3K/AKT信號(hào)發(fā)揮作用的中間產(chǎn)物，其生物活性廣泛，可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝〔5〕。AKT激活時(shí)能減少抑癌基因合成，加快惡性腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視，AKT水平升高往往意味著患者預(yù)后較差。MK2206為AKT抑制劑，具有降低不同亞型AKT 因子活性的作用，在已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)中MK2206具有降低肺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用，但是在結(jié)腸癌中目前尚無(wú)類(lèi)似研究〔6〕。因此，本文通過(guò)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞體外培養(yǎng)，外源性增加不同濃度的MK2206對(duì)其生物活動(dòng)及β-catenin信號(hào)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購(gòu)自武漢普諾賽技。 MK2206(美國(guó) Selleck 公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；GAPDH抗體(艾美捷科技)；β-catenin、p-AKT抗體(中國(guó)MCE)；CCK-8 試劑盒(北京沃比森)；熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑(成都福際)；蛋白垂直電泳系統(tǒng)(北京君意東方)；倒置生物顯微鏡(中國(guó)蘇州景通儀器)。

1.2方法

1.2.1SW480細(xì)胞培養(yǎng) 低溫保存人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480，快速移入37℃水中溶解，離心后，加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，5%CO2、37.5℃培養(yǎng)，貼壁生長(zhǎng)，次日更換新的培養(yǎng)液，生長(zhǎng)到90%時(shí)，加入蛋白液消化，傳代37.5℃保存，以備后用。

1.2.2MK2206溶液制備 將25 mg/ml MK2206溶液溶于200 μl的二甲基亞砜溶液中，將終濃度分別配制成2.5、5.0、10.0 μmol/L備用。

1.2.3CCK-8檢測(cè)INS-1細(xì)胞活力 SW480按照5×103接種到96孔板中，離去舊的培養(yǎng)基后，加入0.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L的MK2206，每組設(shè)置6孔，培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，加入CCK-8培養(yǎng)基，劑量為100 μl 10%，37℃，模擬生理環(huán)境5%CO2，培養(yǎng)3 h，450 nm酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞存活率，存活率計(jì)算參考文獻(xiàn)〔7〕。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 數(shù)目為5×103的SW480細(xì)胞接種到96孔板中，加入0.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L的MK2206，37℃，模擬生理環(huán)境5% CO2培養(yǎng)14 d，手機(jī)克隆復(fù)制的SW480細(xì)胞，加入4%多聚甲醛15 min固定后，用結(jié)晶紫染色液，30 min后。計(jì)算克隆細(xì)胞數(shù)，克隆形成率(%)=(形成的細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.5Hoechst熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 0.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L的MK2206處理后的SW480細(xì)胞，數(shù)目同上，采用40 g/L的多聚甲醛固定0.5 h，采用TrintonX-100透明處理，加入Hoechst熒光材料染色，常溫下0.5 h后，細(xì)胞凋亡：INS-1細(xì)胞核固縮，呈現(xiàn)碎片狀，凋亡率=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6Western印跡檢測(cè)β-catenin、p-AKT抗體蛋白表達(dá) SW480細(xì)胞濃度干預(yù)及數(shù)目同上，高速離心后，保留血清樣本樣孔。進(jìn)行電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡10 min，反復(fù)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，5 min/次，分別加入兔抗人單克隆抗體β-catenin、p-AKT，GAPDH抗體(1∶500)、加入二抗(1∶2 000)，分別雜交，PBS沖洗。浸入ECL工作液，獲取圖象。

1.2.7qRT-PCR檢測(cè)β-catenin、p-AKT mRNA SW480細(xì)胞濃度干預(yù)及數(shù)目同上，沖洗后放于無(wú)菌試管管中，加入β-catenin、p-AKT試劑提取RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，將β-atin載體為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR條件：98℃ 6 min，98℃ 28 s，75℃ 30 s，80℃ 4 min，總計(jì)55個(gè)循環(huán)。β-catenin：正義鏈：5′-CACTCTCGAGATGGCTACTCAAGCTG-3′，反義鏈：5′-CTGCGGATCCTTACAGGTCAGTATCAA-AC-3′；p-AKT：正義鏈：5′-AGTGACTCCTCCACGA-CTGAG-3′，反義鏈：5′-GGTGACTGTGTGAGCGACTTC-3′；β-actin：正義鏈：5′-TTGCCGACAGGATGCA-GAAGGA-3′，反義鏈：5′-AGGTGGACAGCGAGGCCAGGAT-3′。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MK2206對(duì)SW480細(xì)胞形態(tài)的影響 0.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L的MK2206處理后的SW480細(xì)胞24 h后，顯微鏡觀察結(jié)果顯示：未經(jīng)MK2206干預(yù)SW480細(xì)胞呈現(xiàn)梭形密集生長(zhǎng)，癌細(xì)胞之間生長(zhǎng)相互連接，經(jīng)不同濃度的MK2206干預(yù)后的細(xì)胞數(shù)目降低，形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞核固縮，10 μmol/L的MK2206細(xì)胞形成凋亡小體。見(jiàn)圖1。

2.2MK2206對(duì)SW480細(xì)胞克隆數(shù)目影響 2.5 μmol/L組SW480細(xì)胞克隆數(shù)目〔(266.50±13.60)個(gè)〕顯著低于0.0 μmol/L組〔(315.60±20.50)個(gè)，t=3.080，P<0.05〕，5.0 μmol/L組〔(184.20±14.02)個(gè)〕顯著低于2.5 μmol/L組(t=5.385，P<0.05)，10.0 μmol/L組〔(68.92±5.66)個(gè)〕顯著低于5.0 μmol/L組(t=13.960，P<0.05)；見(jiàn)圖2。

2.3MK2206對(duì)SW480細(xì)胞存活率的影響 與0.0 μmol/L組細(xì)胞存活率相比，2.5、5.0、10.0 μmol/L組均顯著下降，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 MK2206對(duì)SW480細(xì)胞形態(tài)的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖2 各組SW480細(xì)胞克隆數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色，×200)

表1 各組細(xì)胞存活率比較

2.4MK2206對(duì)SW480細(xì)胞凋亡率影響 2.5 μmol/L組SW480細(xì)胞凋亡率(8.50±1.69)%顯著高于0.0 μmol/L組〔(4.22±0.80)%,t=13.220，P<0.05〕，5.0 μmol/L細(xì)胞凋亡率〔(14.22±2.30)%〕顯著高于2.5 μmol/L組(t=6.029，P<0.05)，10.0 μmol/L組SW480細(xì)胞凋亡率〔(28.65±3.02)%〕顯著高于5.0 μmol/L組(t=8.402，P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組SW480細(xì)胞凋亡率比較(Hoechst33258染色，×200)

2.5各組SW480細(xì)胞中β-catenin和p-AKT蛋白水平 2.5 μmol/L組SW480細(xì)胞β-catenin和p-AKT蛋白水平顯著低于0.0 μmol/L組(tβ-catenin=3.184，tp-AKT=3.060，均P<0.05)，5.0 μmol/L組β-catenin和p-AKT蛋白水平顯著低于2.5 μmol/L組(tβ-catenin=3.275，tp-AKT=8.227，均P<0.05)，10.0 μmol/L組β-catenin和p-AKT蛋白水平顯著低于5.0 μmol/L組(tβ-catenin=5.039，tp-AKT=5.477，P<0.05)，見(jiàn)表2、圖4。

2.6qRT-PCR檢測(cè)SW480細(xì)胞中β-catenin、AKTmRNA 2.5 μmol/L組SW480細(xì)胞β-catenin和AKT mRNA均顯著低于0.0 μmol/L組(tβ-catenin=4.756，tAKT=3.132，均P<0.05)，5.0 μmol/L組β-catenin和AKT mRNA顯著低于2.5 μmol/L組(tβ-catenin=8.227，tAKT=3.811，P<0.05)，10.0 μmol/L組β-catenin和AKT mRNA均顯著低于5.0 μmol/L組(tβ-catenin=9.959，tAKT=6.235，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組β-catenin和p-AKT蛋白水平比較

1～4：0.0 μmol/L組、2.5 μmol/L組、5.0 μmol/L組、10.0 μmol/L組圖4 各組SW480細(xì)胞中β-catenin和p-AKT蛋白水平

表3 各組β-catenin和AKT mRNA表達(dá)比較

3 討 論

結(jié)腸癌是全球發(fā)病率前3的惡性腫瘤，對(duì)于結(jié)腸癌癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者化療是主要治療方法，但是臨床毒副作用較強(qiáng)，例如腫瘤藥物濃度不足或全身毒副反應(yīng)等。因此，臨床研究熱點(diǎn)在于特異性惡性癌細(xì)胞增殖，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)傷害，從分子治療逐步走向靶向性基因治療。AKT信號(hào)通路抑制劑MK-2206是一種新型治療方式，已經(jīng)證實(shí)在乳腺癌、膀胱癌等作用較好。

結(jié)腸癌細(xì)胞的形成是多環(huán)境多致癌因素大量表達(dá)，致癌物質(zhì)發(fā)生免疫逃竄，導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)失衡，大量分泌導(dǎo)致異常增生。SW480細(xì)胞增殖、復(fù)制能力較強(qiáng)，能夠通過(guò)減少細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)DNA快速?gòu)?fù)制，加大癌細(xì)胞有絲分裂，加快新病灶形成及向旁癌組織擴(kuò)散〔8〕。研究表明結(jié)腸癌的形成屬于基因病變，與致癌信號(hào)、抑癌信號(hào)及基因修復(fù)損傷存在關(guān)聯(lián)〔9〕。AKT信號(hào)通路是目前研究較多的信號(hào)通路，在細(xì)胞中有信號(hào)傳導(dǎo)作用，在參與正常細(xì)胞的新陳代謝同時(shí)，在腫瘤中有促進(jìn)作用。在結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有磷酸化p-AKT表達(dá)升高，異?；顒?dòng)程度調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞生物行為。AKT在結(jié)腸癌患者組織中呈現(xiàn)高表達(dá)在息肉或癌旁組織中表達(dá)降低。因此，臨床針對(duì)惡性AKT表達(dá)的抑制劑不斷增加，MK2206屬于口服變構(gòu)蛋白激酶，對(duì)AKT下游多個(gè)亞型進(jìn)行抑制，例如AKT1、2等〔10〕。在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，MK2206聯(lián)合西藥能減少癌細(xì)胞存活及再生，加快細(xì)胞凋亡明顯優(yōu)于單純西藥治療。在膀胱癌細(xì)胞中，不同濃度的MK2206均對(duì)癌細(xì)胞存活率有抑制作用，作用機(jī)制在于降低PI3K/AKT介導(dǎo) GSK-3β磷酸化的能力〔11〕。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，MK2206能通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)減少癌細(xì)胞中金屬蛋白酶表達(dá)。Yang等〔12〕研究表示，AKT被激活能加快結(jié)腸癌細(xì)胞再生及血管生成，通過(guò)上調(diào)缺氧因子，而減少癌細(xì)胞凋亡，而MK2206能阻斷AKT與P13K信號(hào)通路發(fā)生交叉，減少下游因子激活，從而改善病情。臨床研究表示，在中晚期實(shí)體腫瘤患者中采用MK2206治療效果較好，患者耐受性較好。本研究表明在結(jié)腸癌細(xì)胞中，外源性增殖AKT抑制物MK2206能有效降低細(xì)胞生理活動(dòng)，減少?gòu)?fù)制及生存，加快細(xì)胞核固縮，形成凋亡小體，抑制劑的濃度越高作用越明顯。

在正常機(jī)體中，β-catenin存在細(xì)胞漿內(nèi)能通過(guò)多種泛素化依賴(lài)蛋白而抑制β-catenin水平，遏制其進(jìn)入細(xì)胞核〔13〕。Fu等〔14〕研究表示，Wnt信號(hào)通過(guò)能夠與Frz形成復(fù)合物，抑制β-catenin磷酸化形成。而當(dāng)β-catenin信號(hào)發(fā)生突變時(shí)，能減少抑制其降解的物質(zhì)形成，提高β-catenin在細(xì)胞表達(dá)。研究表明，多數(shù)癌癥患者機(jī)體中β-catenin的表達(dá)都有提升，異常表達(dá)的β-catenin 可加劇機(jī)體免疫細(xì)胞的損傷，如在膠質(zhì)瘤中β-catenin信號(hào)表達(dá)受到抑制后，癌細(xì)胞的放射敏感性就會(huì)降低，從而提高放療和化療的效果〔15〕。β-catenin通路在眾多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，在胃癌和子宮內(nèi)膜癌中的異常變化有重要參考價(jià)值。β-catenin通路信號(hào)被激活時(shí)，會(huì)加快結(jié)腸癌細(xì)胞的分化，導(dǎo)致腫瘤形成。趙雪等〔16〕研究表明β-catenin能快速進(jìn)入細(xì)胞核中，與LEF等轉(zhuǎn)錄因子相互作用促使結(jié)腸癌細(xì)胞分化。唐秀娟等〔17〕研究表示，β-catenin能加快結(jié)腸癌細(xì)胞中GSK-3β磷酸化，誘導(dǎo)AKT水平升高。相關(guān)研究表示，磷酸化p-AKT能增加結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過(guò)建立體外結(jié)腸癌大鼠模型發(fā)現(xiàn)p-AKT表達(dá)增加。p-AKT異常活化能增加核因子水平，能夠上調(diào)血管生成因子加快癌細(xì)胞生成及復(fù)制〔18〕。已有研究表示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中通過(guò)外源性增加AKT抑制劑，減少p-AKT水平而改善腫瘤生長(zhǎng)〔19〕。Choi等〔20〕研究表明在乙型肝炎中AKT抑制物能通過(guò)抑制ZEB1表達(dá)而降低β-catenin水平。結(jié)腸癌細(xì)胞中經(jīng)AKT抑制物MK2206處理后，GSK-3β水平降低，導(dǎo)致對(duì)β-catenin異常表達(dá)的能力減弱，導(dǎo)致β-catenin蛋白降低。研究表明在結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)AKT抑制物MK2206處理后，細(xì)胞中β-catenin中下游因子cyclin D1基因表達(dá)，降低β-catenin。本研究結(jié)果說(shuō)明MK2206能降低結(jié)腸癌中β-catenin和p-AKT水平并與抑制劑濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

本研究存在一定的不足，由于時(shí)間、成本等問(wèn)題，未采取AKT激動(dòng)劑進(jìn)行試驗(yàn)，可能會(huì)存在局限性，在今后的研究中應(yīng)加入更多的實(shí)驗(yàn)方法，為結(jié)腸癌的治療提供更有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。綜上，AKT抑制劑MK2206能減少人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480生理活動(dòng)，降低存活率，加快凋亡，能顯著抑制β-catenin、p-AKT活性，隨著MK2206濃度增加而降低。