張孟琪，秦公偉, 2, 3, 4*，曹小勇, 2, 3，胡選萍, 2，黃大濤，席進(jìn)成

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，陜西 漢中 723000；3.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；4.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000)

0 引言

【研究意義】藍(lán)莓學(xué)名越橘，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物[1]，果實(shí)為小漿果，多為藍(lán)色，俗稱藍(lán)莓。藍(lán)莓果肉香甜，具獨(dú)特風(fēng)味，富含多種氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，尤其含有大量的花青素和黃酮，具有保護(hù)視力、增強(qiáng)人體免疫力等保健作用[2-3]。在水果市場(chǎng)中，藍(lán)莓廣受消費(fèi)者的歡迎，也受到生產(chǎn)者、農(nóng)業(yè)科學(xué)家和政府的關(guān)注，藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊。我國于2000年開始藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[4]，截至2020年底，全國藍(lán)莓栽培面積6.64萬hm2，總產(chǎn)量34.72萬t，主要分布在貴州、遼寧、山東、四川、安徽、云南等省，經(jīng)濟(jì)效益顯著[5]，對(duì)增加農(nóng)民收入有重要意義。【前人研究進(jìn)展】組織培養(yǎng)技術(shù)是藍(lán)莓生產(chǎn)育苗的主要方式，現(xiàn)已開展了大量藍(lán)莓組培方面的研究[6-18]，但研究深度和系統(tǒng)性有望得到進(jìn)一步完善，可以通過改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)降低污染率、提升增殖倍數(shù)[11]，有助于提高苗木生產(chǎn)效益。陜西藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)起步較晚，從2012年開始規(guī)?；N植[6]，主要栽培高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓兩大類型系列品種[7]。布里吉塔為北高叢藍(lán)莓晚熟品種，果實(shí)大、風(fēng)味佳，一直是澳大利亞和智利的主栽品種；在國內(nèi)引種栽培后發(fā)現(xiàn)，該品種在不同的栽培地區(qū)，表現(xiàn)存在差異性。在北方產(chǎn)區(qū)多存在花芽分化不良、產(chǎn)量低等問題[8]，但在陜西栽種長勢(shì)好、果實(shí)大、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，綜合表現(xiàn)良好?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】布里吉塔作為區(qū)域性適生品種，目前未得到國內(nèi)苗木生產(chǎn)企業(yè)的重視，其組培苗一直處于缺乏狀態(tài)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以陜西藍(lán)莓適生品種布里吉塔為試驗(yàn)材料，研究外植體采集時(shí)間、不同外植體、玉米素核苷(ZT)濃度、細(xì)胞分裂素種類對(duì)組培苗無菌體系建立的影響，旨在為陜西藍(lán)莓適生品種苗木生產(chǎn)提供技術(shù)支持，同時(shí)為藍(lán)莓組培無菌體系建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

北高叢藍(lán)莓品種布里吉塔(Brigita Blue)春梢，2021年4月6日至5月24日采自勉縣陜西理工大學(xué)秦巴藍(lán)莓研究所校企合作共建藍(lán)莓試驗(yàn)示范基地。

1.2 方法

1.2.1 取材 從2021年4月6日開始，隔15 d取材1次，共4個(gè)取材時(shí)期，分別為4月6日、4月18日、5月5日和5月24日。選擇栽種5年以上、生長健壯且無病害植株，采集當(dāng)年春梢，裝入潔凈保鮮袋，帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2.2 材料預(yù)處理 春梢去除下部木質(zhì)化過高部分，留取上部幼嫩枝條，長度≤15 cm，剪去葉片(注意保留葉柄)，裝入干凈的廣口瓶；1 L帶刻度燒杯擠入洗潔精(約1 mL)，加入純凈水?dāng)嚢杈鶆颉⑾礉嵕芤旱谷霃V口瓶振蕩清洗材料，再用純凈水沖洗5次，每日早晚再用純凈水各沖洗1次，2 d后接種。

1.2.3 材料接種 超凈臺(tái)通風(fēng)和紫外滅菌后，依次將材料用75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒8 min，無菌水沖洗4～5遍，放入墊有濾紙的無菌培養(yǎng)皿。接種時(shí)將消毒的枝條按照生長成熟度切分為莖上段、莖中上段、莖中下段和莖下段4個(gè)部分，但由于4月上旬的枝條較短且未完全成熟，只能切分為莖上段、莖中上段和莖中下段3個(gè)部分。將4部分莖段剪為長約2 cm的外植體，接種到培養(yǎng)基中，每瓶接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理接種4瓶，重復(fù)3次。接種后，置于(25±2)℃培養(yǎng)室，光照強(qiáng)度2 500～3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

當(dāng)腋芽萌發(fā)的新梢生長緩慢時(shí)，剪為長約1.5 cm莖段，接種到繼代培養(yǎng)基中。接種數(shù)量、培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)基 初代培養(yǎng)選用1/2 MS + 1/2 WPM營養(yǎng)組分的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉7 g/L、調(diào)pH值5.8，ZT濃度設(shè)置1 mg/L、1.25 mg/L、1.5 mg/L 3個(gè)水平。繼代培養(yǎng)基中分別添加1.5 mg/L ZT和1.5 mg/L tZR，其他成分同初代培養(yǎng)基。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

外植體接種后第2天開始觀察統(tǒng)計(jì)組培苗生長情況，隔日統(tǒng)計(jì)污染率1次；連續(xù)5 d未觀察到有新的腋芽萌發(fā)時(shí)統(tǒng)計(jì)萌芽率；約60 d組培苗進(jìn)入直線生長末期后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。

污染率=(污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

總成活外植體數(shù)=接種外植體數(shù)-污染外植體數(shù)-褐化死亡外植體數(shù)

萌芽率=(萌芽的外植體個(gè)數(shù)/總成活外植體數(shù))×100%

增殖倍數(shù)=可以繼代接種的莖段數(shù)/總成活外植體數(shù)

其中，可以繼代接種的莖段數(shù)為初代培養(yǎng)外植體腋芽萌發(fā)生長獲得的新梢，繼代培養(yǎng)超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌操作過程中，在培養(yǎng)皿中切分獲得長度≥1.5 cm的莖段總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016和GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計(jì)與分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Turkey檢驗(yàn)法進(jìn)行組間顯著性差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同ZT濃度處理外植體的萌發(fā)率及增殖倍數(shù)

5月5日第3批次采集的外植體，接種在不同ZT濃度(1 mg/L、1.25 mg/L、1.5 mg/L)的初代培養(yǎng)基上，腋芽約7 d開始膨大。由表1可知，ZT對(duì)藍(lán)莓布里吉塔莖段的腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)和生長有良好作用，當(dāng)ZT濃度為1 mg/L時(shí)，萌芽率最高，為77.78%；其次為ZT 1.5 mg/L，為73.33%；ZT為1.25 mg/L時(shí)，萌芽率相對(duì)較低，僅61.67%。外植體的增殖倍數(shù)以ZT 1.25 mg/L最高，為3.75倍；其次為ZT 1 mg/L，為2.94倍；ZT 1.5 mg/L最低，僅2.40倍，但不同濃度間增殖倍數(shù)未達(dá)到顯著水平。3種ZT濃度的培養(yǎng)基均可作為藍(lán)莓品種布里吉塔的初代培養(yǎng)基(圖1)，其中以ZT濃度為1.25 mg/L時(shí)效果最佳。

表1 不同ZT濃度處理外植體的萌發(fā)率及增殖倍數(shù)

注：A，培養(yǎng)基中ZT濃度1.0 mg/L；B，1.25 mg/L；C，1.5 mg/L。

2.2 不同外植體處理初代培養(yǎng)的差異

從圖2可知，5月5日第3批次采集的外植體4 d后開始出現(xiàn)污染，第10天污染率達(dá)到峰值。其中，莖上段的污染率最高，為34.78%；莖中上段(8.33%)和莖中下段(4.76%)次之；莖下段污染率最低，僅4.35%，不同莖段的污染率有明顯區(qū)別。僅從污染率看，莖中上段、莖中下段和莖下段作為外植體建立無菌體系效果較佳。莖上段污染率高的原因可能是在去除葉片時(shí)產(chǎn)生較多切面，且殘留的葉柄不脫落，容易導(dǎo)致污染；莖下段污染率低的原因可能是葉柄部分在預(yù)處理和消毒的沖洗過程中部分自行脫落，污染率降低。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P< 0.05)。

莖下段萌芽率最高，為83.33%；莖中上段(81.25%)和莖上段(63.33%)其次；莖中下段最低，僅56.25%，但不同外植體之間萌芽率差異不顯著。不同莖段的增殖倍數(shù)與萌芽率呈現(xiàn)的規(guī)律不同，莖下段的增殖倍數(shù)最高，為4.81倍；莖中下段(3.35倍)和莖中上段(2.83倍)其次；莖上段最低，僅0.90倍，不同外植體之間的增殖倍數(shù)差異達(dá)到顯著水平。不同外植體在培養(yǎng)基中的生長狀況不同(圖3)，以莖上段作為外植體的組培苗，植株矮小，生長緩慢；以莖中上段、莖中段和莖中下段作為外植體的組培苗生長健壯。綜合污染率、萌芽率、增殖倍數(shù)和組培苗的生長狀況4個(gè)試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)認(rèn)為，以莖中下段和莖下段作為外植體，建立無菌體系效果較好。

注：A，莖上段；B，莖中上段；C，莖中下段；D，莖下段。

2.3 不同采集時(shí)間外植體的污染率、萌發(fā)率及增殖倍數(shù)

由表2可知，4—5月采集外植體的污染率在13.06%～37.68%，萌芽率為68.18%～74.00%，增殖倍數(shù)為1.22～3.07倍。不同批次采集對(duì)外植體萌芽率的影響差異不顯著，而增殖倍數(shù)達(dá)到顯著水平。第2批次采集的外植體污染率較高，應(yīng)是由于4月中下旬氣溫開始升高，材料帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)處理沖洗后，未考慮溫度影響放置冰箱低溫貯藏，外植體殘留的菌體不斷繁殖、侵入傷口，導(dǎo)致接種后出現(xiàn)較多污染。綜合上述，外植體采樣時(shí)間對(duì)藍(lán)莓初代培養(yǎng)的增殖倍數(shù)有重要影響。在無菌體系建立中，4—5月均可進(jìn)行外植體采集，最佳采集時(shí)間為5月份。

表2 不同采集時(shí)間處理外植體的污染率、萌發(fā)率及增殖倍數(shù)

2.4 不同細(xì)胞分裂素處理組培苗的繼代增殖狀況

將初代培養(yǎng)獲得的新梢切分后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中，約7 d發(fā)現(xiàn)腋芽開始膨大，葉片展開。從表3可知，在組培苗的繼代培養(yǎng)過程中，2種細(xì)胞分裂素之間萌芽率和增殖倍數(shù)的差異未達(dá)顯著水平。從圖4看出，組培苗在添加tZR的培養(yǎng)基上生長更旺盛，葉色濃綠。從組培苗的生長狀況看，tZR更有利于藍(lán)莓組培苗的增殖培養(yǎng)。

表3 不同細(xì)胞分裂素處理組培苗的繼代增殖狀況

注：A，培養(yǎng)基中添加ZT；B添加tZR。

3 討論

藍(lán)莓組織培養(yǎng)中，外植體的選擇在一定程度上影響快繁體系的建立。研究發(fā)現(xiàn)，布里吉塔春梢上部幼嫩枝條切分獲得的莖中下段和莖下段作為外植體的效果更佳，春梢上部幼嫩枝條最成熟的部分，組培增殖效果最佳，與王大平[13]對(duì)兔眼藍(lán)莓的研究結(jié)果一致。

采樣時(shí)間也是成功建立無菌體系的重要因素。通過試驗(yàn)得出，4—5月均可進(jìn)行藍(lán)莓外植體采集，5月最佳，與周閏等[14-16]的研究結(jié)果一致。原因應(yīng)是5月采集的春梢木質(zhì)化程度更高，同時(shí)枝條貯藏的營養(yǎng)更多，從而表現(xiàn)出作為外植體時(shí)增殖倍數(shù)顯著高于4月。

培養(yǎng)基是外植體誘導(dǎo)生長的重要營養(yǎng)來源，在組織培養(yǎng)過程中起著不可替代的作用。培養(yǎng)基中添加3種ZT濃度(1 mg/L、1.25 mg/L、1.5 mg/L)均可在初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，與李森等[12]的研究結(jié)果相同。從節(jié)約生產(chǎn)成本角度出發(fā)，建議使用低濃度ZT(1.0 mg/L)進(jìn)行初代培養(yǎng)。

在植物組培無菌體系建立過程中，添加細(xì)胞分裂素可促進(jìn)莖段腋芽萌發(fā)。在藍(lán)莓組培苗的第1次繼代時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)添加tZR更有利于增殖培養(yǎng)，與尹利方等[17]的研究結(jié)果一致，與張力思等[18]認(rèn)為添加ZT對(duì)藍(lán)莓莖段增殖效果最佳的結(jié)論不同，可能是由于藍(lán)莓不同品種在增殖階段對(duì)細(xì)胞分裂素的需求不同。

試驗(yàn)建立了藍(lán)莓品種布里吉塔的無菌培養(yǎng)體系，下一步將對(duì)該品種的繼代培養(yǎng)、生根和馴化進(jìn)行系統(tǒng)研究，為藍(lán)莓其他品種組培的系統(tǒng)研究提供思路及數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

通過組培快繁技術(shù)建立藍(lán)莓品種布里吉塔的組培無菌體系時(shí)，應(yīng)在5月進(jìn)行外植體采集，并使用幼嫩春梢的中下部分作為外植體，最佳初代培養(yǎng)基為1/2 MS+1/2 WPM+ZT 1.0 mg/L，初代培養(yǎng)誘導(dǎo)新梢在繼代培養(yǎng)基為1/2 MS + 1/2 WPM+1.5 mg/L tZR中成功繼代，且生長狀態(tài)良好。