白志鵬，曹美娜，張 娜，陳開廷，馬 靜，劉玉婷，馬 婧，高金亮*

(鄂爾多斯市中心醫(yī)院 1.器械科；2.分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3.檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古自治區(qū) 鄂爾多斯市 017000)

常見致病菌的種類繁多，但感染后的臨床表現(xiàn)又非常相似，而最佳治療方案的制定取決于對致病菌種類的精準(zhǔn)鑒定[1]?？焖儆志珳?zhǔn)的鑒定細(xì)菌是協(xié)助臨床正確治療和提高療效的前提和關(guān)鍵，是臨床微生物領(lǐng)域的重要工作。

目前用于細(xì)菌分類鑒定的常用方法有傳統(tǒng)表型鑒定法和核酸鑒定法[2]。表型鑒定法是目前最通用的方法，盡管已有成熟的全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，但鑒定前需要對細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，且只針對已知菌。而對于結(jié)核分枝桿菌、彎曲菌屬等一些少見或難以培養(yǎng)的細(xì)菌的鑒定能力仍然有限[3]。分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為快速鑒定微生物種類成為可能，其穩(wěn)定與準(zhǔn)確性能彌補(bǔ)傳統(tǒng)表型鑒定法鑒定微生物的不足。近年來，16S rRNA序列分析法在細(xì)菌鑒定中受到了越來越多的關(guān)注。16S rRNA廣泛存在于原核細(xì)胞中，約1.5 kb大小，其序列由恒定區(qū)和可變區(qū)組成，因其能體現(xiàn)不同菌屬間的差異，已成為理想的基因鑒定靶序列。通常的做法是利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，PCR反應(yīng)擴(kuò)增16S rRNA序列，根據(jù)可變區(qū)序列的差異對細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定[4]。16S rRNA序列分析法鑒定微生物具有高靈敏度和特異性，檢測時(shí)間較短，不依賴于微生物的分離培養(yǎng)，是細(xì)菌鑒定與分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。本研究利用16S rRNA序列分析法鑒定臨床實(shí)驗(yàn)室不能準(zhǔn)確鑒定的菌株，以補(bǔ)充表型鑒定法在細(xì)菌鑒定中的不足。

1 材料與方法

1.1 臨床菌株來源

收集2017年4月至2018年4月鄂爾多斯市中心醫(yī)院康巴什部檢驗(yàn)科臨床微生物實(shí)驗(yàn)室經(jīng)VITEK 2 Compact自動(dòng)鑒定儀難以鑒定的未知菌株32株。

1.2 主要儀器及試劑

VITEK 2 Compact自動(dòng)鑒定儀及GN、GP、ANC、NH細(xì)菌鑒定卡(法國生物梅里埃公司)，BG-Power600穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀與凝膠成像系統(tǒng)(北京百晶生物技術(shù)有限公司)，梯度PCR儀(美國Nyx Technik)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒與瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，Premix Taq、DL2000 DNA Marker與10×Loading Buffer(日本TaKaRa公司)，GoldView染料(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)，DL3000 DNA Marker(南京博爾迪生物科技有限公司)；其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、霍氏腸桿菌ATCC 700323、肺炎鏈球菌ATCC 49619，購自國家衛(wèi)生部臨檢中心，用于評價(jià)16S rRNA序列分析法鑒定細(xì)菌的準(zhǔn)確性。所有菌株保存于-80℃冰箱。

1.4 方法

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 體液及尿液標(biāo)本接種在血瓊脂及中國藍(lán)培養(yǎng)基，痰液標(biāo)本接種在血瓊脂、巧克力及中國藍(lán)培養(yǎng)基，腦脊液標(biāo)本接種在血瓊脂及無萬古霉素巧克力培養(yǎng)基。對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，革蘭陽性球菌用GP鑒定卡，革蘭陽性桿菌用ANC鑒定卡，革蘭陰性桿菌用GN鑒定卡，革蘭陰性球菌和苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌用NH鑒定卡，上機(jī)操作按照VITEK 2 Compact自動(dòng)鑒定儀說明書進(jìn)行。

1.4.2細(xì)菌總DNA提取 將單一菌落接種于Broth肉湯37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，取0.5 ml菌液室溫8 000 r/min 離心1 min，棄上清，保留沉淀用于細(xì)菌基因組DNA的提取。具體按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3基因擴(kuò)增 基于對細(xì)菌16Sr RNA基因序列分析比對的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物，委托北京六合華大基因科技有限公司合成。引物序列如下：①上游引物F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；②下游引物R：5’-GGHTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應(yīng)體系(50 μl)：上、下游引物(50 μmol /L)各1 μl、DNA模板2 μl、PCR Master Mix 25 μl(含d NTPs、Taq DNA酶、Mg2+)、滅菌去離子水21 μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，54℃退火60 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

1.4.4PCR產(chǎn)物電泳檢測與測序 取PCR產(chǎn)物5 μl用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外凝膠成像儀拍照記錄。利用PCR膠回試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.5 PCR產(chǎn)物測序分析將測序所得序列用DNAstar 7.0軟件進(jìn)行分析，去除兩端圖譜紊亂序列，并拼接。登陸GenBank和核糖體工程數(shù)據(jù)庫(RDP)，在GenBank應(yīng)用BLAST對獲得的基因片段進(jìn)行同源性檢索比對，初步得到細(xì)菌屬種信息，在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)網(wǎng)頁中篩選模式菌株，參考美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI MM18-A解釋標(biāo)準(zhǔn)[6]：①與參考菌株相似度≥99.0%且與其他種相似度之差>0.8%，報(bào)告種名；②與參考菌株相似度≥99.0%但相似度之差<0.8%，應(yīng)報(bào)告其屬名和所有相似度≥99.0%的種名；③與某菌屬相似度在97.0%-98.9%之間且能與其他菌屬相區(qū)分，報(bào)告屬名；④與所有菌種的模式菌株相似度<97%，報(bào)告為可能的新屬新種，再利用RDP 數(shù)據(jù)庫序列比對再次確認(rèn)細(xì)菌種屬信息[7]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

以5株標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，獲得大小約為1 500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。測序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物序列與核酸數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)菌株序列完全符合。

M:DNA Marker;1:陰性對照;2:金黃色葡萄球菌;3:大腸埃希菌;4:銅綠假單胞菌;5:霍氏腸桿菌;6:肺炎鏈球菌圖1 標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR電泳圖

2.2 32株實(shí)驗(yàn)菌株電泳結(jié)果

以所提取的實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，獲得大小約為1 500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小吻合(圖2)。

M:DNA marker;1:陰性對照;2:金黃色葡萄球菌陽性對照;3-34:實(shí)驗(yàn)菌株圖2 實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)CR電泳圖

2.3 32株實(shí)驗(yàn)菌株鑒定結(jié)果

Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，29株(90.6%)實(shí)驗(yàn)菌株被鑒定到“種”，其中2株(6.9%)被鑒定到“亞種”，3株(9.4%)被鑒定到“屬”，再通過LPSN搜索和RDP確定，其中革蘭氏陽性球菌占比40.6%，革蘭氏陰性和陽性桿菌各占25%，抗酸桿菌占6.3%，支原體占3.1%(表1)。

表1 16S rRNA 序列分析鑒定結(jié)果

3 討論

Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀將細(xì)菌分為兩類并配備了相應(yīng)的藥敏鑒定卡，其敏感性高于傳統(tǒng)細(xì)菌分類鑒定方法[8]。但其底物濃度、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分等都可能影響細(xì)菌的生化反應(yīng)特性，從而干擾鑒定結(jié)果；同時(shí)由于細(xì)菌本身原因也會(huì)導(dǎo)致某些生化反應(yīng)不典型從而影響儀器鑒定的準(zhǔn)確性。細(xì)菌16S rRNA基因序列長度適宜，在細(xì)菌中含量多，故常被作為細(xì)菌學(xué)的靶標(biāo)。通常在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能否擴(kuò)增出預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物可作為細(xì)菌的存在有否的依據(jù)；進(jìn)一步對擴(kuò)增產(chǎn)物序列的分析，可以對細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定和分類。此方法具有穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、適用面廣、費(fèi)用低、可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)[9]，16S rRNA基因序列分析法能鑒定大部分病原細(xì)菌。特別是對某些非典型菌、少見菌、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)困難的細(xì)菌、以及發(fā)現(xiàn)和描述新型微生物菌株等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值，可以作為臨床細(xì)菌鑒定的常規(guī)補(bǔ)充方法[10-11]。

本研究運(yùn)用16S rRNA序列分析技術(shù)，對臨床無法鑒別的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，5株標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫中公布的已知序列完全符合；32株臨床分離株16S rRNA核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫中公布的已知序列符合率達(dá)到99%-100%，類似性積分Max Score>1800，匹配期望值E均為0，匹配程度較高。鑒定到種水平成功率為90.6%，高于以往報(bào)道的常規(guī)方法的鑒定成功率[12]。在鑒定的32株細(xì)菌中，鼻疽諾卡菌、無枝菌酸棒桿菌、科伊爾棒桿菌、惰性乳桿菌等屬于疑難菌，嚙蝕艾肯菌屬于苛養(yǎng)菌，傳統(tǒng)方法鑒定較難；其它雖屬于常見菌，但形態(tài)、生化反應(yīng)不典型，傳統(tǒng)方法也不易于鑒別。由此可見，16S rRNA基因序列分析法精準(zhǔn)、適用面廣，可以作為臨床鑒定病原菌的一種有效補(bǔ)充方法。

盡管如此，16S rRNA基因序列分析法仍存在很多局限：①無國際公認(rèn)的使用規(guī)則及測序結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)；②對數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)確性依賴程度較高[13]；③基因組內(nèi)的變異、基因的插入缺失或基因的水平轉(zhuǎn)移等均可能影響其鑒定的準(zhǔn)確性[14-15]；④PCR反應(yīng)時(shí)可能出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配等因素，影響序列分析的準(zhǔn)確性[14]；⑤16S rRNA序列測定成本相對較高，耗時(shí)較長，也限制了其臨床應(yīng)用[16]。相信隨著分子生物學(xué)與信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展和技術(shù)手段的更新，特別是精準(zhǔn)治療在臨床上的廣泛應(yīng)用，分子遺傳學(xué)鑒定能夠更加靈活、快速地早期診斷細(xì)菌感染。