楊曉玲，何大保，陳 塵，匡文斌，張勇剛

(1.深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518105；2.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科)

乳腺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率極高，也是導(dǎo)致女性癌癥死亡的重要原因[1]。與多數(shù)國(guó)家相似，乳腺癌在國(guó)內(nèi)的發(fā)病率居于女性惡性腫瘤的首位，中國(guó)乳腺癌病例數(shù)量占所有新診斷的惡性腫瘤的12.2%，死亡率占世界總死亡率的9.6%[2]。乳腺癌多發(fā)于40歲以上的女性，僅對(duì)4%-6%的40歲以下的年輕女性有影響[3]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是涉及到多種細(xì)胞類型的多步驟過程，目前而言，加強(qiáng)早期篩查是預(yù)防乳腺癌發(fā)生的最佳手段。有研究指出，對(duì)于發(fā)達(dá)地區(qū)而言，早期預(yù)防得當(dāng)?shù)娜橄侔┗颊呶迥晟媛矢哌_(dá)80%[4]。而對(duì)于中晚期的患者而言，臨床多采用手術(shù)治療、放射治療、化療治療、內(nèi)分泌治療以及免疫靶向治療的手段進(jìn)行。大量的研究指出，多種細(xì)胞因子、miRNAs、LncRNAs以及信號(hào)通路均是乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)[5]。著絲粒是真核生物的染色體位點(diǎn)，在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中使動(dòng)粒形成并附著在紡錘體微管上，參與調(diào)控染色體分離[6]。著絲粒蛋白基因K(CENPK)是著絲粒家族的一員，位于5q12.3染色體上，由269個(gè)核苷酸構(gòu)成。最新的研究也發(fā)現(xiàn)，CENPK在卵巢癌、肝細(xì)胞癌以及肺腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并與患者的不良預(yù)后有關(guān)[7]。本次實(shí)驗(yàn)探究過表達(dá)CENPK基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞系MCF-7細(xì)胞體外增殖和侵襲的影響，并探究其調(diào)控機(jī)制，具體內(nèi)容如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞、人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences，Shanghai，China)。將MCF-7、MCF-10細(xì)胞分別放置于含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)和1%青霉素/鏈霉素(Invitrogen，CA，USA)的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下3天換液1次。0.25%的胰蛋白酶(Thermo Fisher HyClone，Utah，USA)消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以5×106個(gè)/孔種植于6孔板中，取穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞按FuGENE○RHD Transfection Reagent(Roche,Shanghai，China)的說明書將CENPK過表達(dá)質(zhì)粒及空白對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，再將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 CCK8法(Cell Counting Kit-8，CCK8)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取經(jīng)上述方法轉(zhuǎn)染了CENPK過表達(dá)質(zhì)粒及空白對(duì)照質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為2×103，接種于96孔板中。加入200 μl的DMEM(Thermo Fisher Scientific，Inc.)培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%融合時(shí)，更換成無血清培養(yǎng)基，24 h后加入血清。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，向每孔中加入10 μl的CCK8溶液(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)，按CCK8說明書測(cè)量不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h)下MCF-7細(xì)胞在波長(zhǎng)為450 nm的吸光度值。

1.3 qRT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

采用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和用PrimeScript-RT Kit(Madison，WI，USA)將MCF-7細(xì)胞內(nèi)總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBR GreenPCR試劑(MedChemExpress，NJ,USA)和ABI7500FAST Real-Time PCR儀(Applied Biosystems,SanFrancisco，CA，United States)以2-ΔΔCt方法[8]評(píng)估用GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參后CENPK基因的mRNA表達(dá)。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的經(jīng)不同處理的MCF-7細(xì)胞，按2×104個(gè)/孔加入Transwell上室，下室中加600 μl的含20%FBS的培養(yǎng)液，37℃條件下培養(yǎng)。12 h后去除上室細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室細(xì)胞，0.1%的結(jié)晶紫染色，晾干后拍照并計(jì)數(shù)。

1.5 Western Blot檢測(cè)AKT/MDM2/TP53信號(hào)通路的蛋白表達(dá)

取2×106個(gè)經(jīng)不同轉(zhuǎn)染處理的MCF-7細(xì)胞，冷PBS洗滌3次后，加入裂解液(RIPA)裂解各組細(xì)胞，BCA法測(cè)定上清液中的蛋白濃度。取50 g總蛋白凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。再用5%的脫脂奶粉封閉2 h后，用0.05%的緩沖液(TBST)洗細(xì)胞3次。與購(gòu)自Abcam、MA、USA，濃度為1∶1 000的AKT(ab8805)、p-AKT(ab38449)、MDM2(ab16895)、p-MDM2(ab170880)、TP53(ab26)、p-TP53(ab33889)、β-actin(ab115777)一抗在4℃下孵育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的濃度為1∶3 000的抗兔二抗孵育1 h。TBST再次洗膜3次后用Western blot專用試劑(Invitrogen公司)顯色成像，Image J分析灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CENPK基因在乳腺癌細(xì)胞及組織中高表達(dá)

如圖1所示，通過查閱癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)比1 085例腫瘤組織標(biāo)本和291例正常組織中CENPK基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CENPK在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.05)。圖2的結(jié)果顯示，乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)的CENPK基因的表達(dá)明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A細(xì)胞(P<0.05)。

圖1 CENPK基因在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)*P<0.05(與癌旁正常組織相比)

圖2 CENPK基因在乳腺癌細(xì)胞及正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)*P<0.05(與正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10細(xì)胞相比)

2.2 轉(zhuǎn)染CENPK過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)CENPK基因表達(dá)的影響

向MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CENPK過表達(dá)質(zhì)粒，qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，如圖3所示，與空白對(duì)照組(vector)相比，轉(zhuǎn)染了CENPK過表達(dá)質(zhì)粒的CENPK組的CENPK基因表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖3 CENPK基因在MCF-10細(xì)胞中的表達(dá)*P<0.05(與空白對(duì)照組vector相比)

2.3 過表達(dá)CENPK對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

采用CCK8法檢測(cè)不同時(shí)間下(0、24 h、48 h、72 h)經(jīng)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞在波長(zhǎng)為450 nm的吸光度值，如圖4所示，與空白對(duì)照組vector相比，過表達(dá)CENPK顯著誘導(dǎo)了乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖(P<0.05)。

圖4 CENPK基因?qū)CF-7細(xì)胞增殖的影響**P<0.01(與空白對(duì)照組vector相比)

2.4 過表達(dá)CENPK對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

為了探究過表達(dá)CENPK對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響，采用Transwell法檢測(cè)經(jīng)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果如圖5、圖6所示，與空白對(duì)照組vector相比，過表達(dá)CENPK顯著促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移(P<0.05)。

圖5 CENPK基因MCF-7細(xì)胞遷移的影響

圖6 CENPK基因MCF-7細(xì)胞遷移的影響***P<0.001(與空白對(duì)照組vector相比)

2.5 過表達(dá)CENPK激活A(yù)KT、MDM2，抑制TP53

為了進(jìn)一步探究CENPK過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的潛在機(jī)制，采用Western Blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞內(nèi)AKT/MDM2/TP53信號(hào)通路及其磷酸化的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖7所示，與vector組相比，過表達(dá)CENPK激活了AKT和MDM2的磷酸化，抑制了TP53的磷酸化。

圖7 過表達(dá)CENPK對(duì)AKT/MDM2/TP53通路的影響

3 討論

乳腺癌是全球范圍內(nèi)常見的癌癥之一，也是女性癌癥的第二大死亡因素[9]。作為一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，乳腺癌是由多種危險(xiǎn)因素造成的，包括女性患者的年齡、種族、初潮史、乳房特征、生殖模式、激素使用情況、吸煙飲酒史、體力勞動(dòng)以及生活習(xí)慣等[10]。對(duì)于已經(jīng)確診為乳腺癌患者，臨床治療的目的在于延長(zhǎng)患者的生存周期，提高患者的生活質(zhì)量。先前的研究證實(shí)，處方藥洛巴鉑(Loubo)和培美曲塞治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的療效尚可[11]，但不良反應(yīng)也較為明顯，且治療成本相對(duì)較高。最新的研究表明，乳腺癌的進(jìn)展與包括BRCA 1以及p53等腫瘤易感基因在內(nèi)的多種分子活性的失調(diào)有關(guān)[12]，靶向分子療法通過糾正與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)的分子畸形，顯著抑制乳腺癌的疾病進(jìn)展，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力[13]。本次實(shí)驗(yàn)探究CENPK基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞體外增殖及遷移和影響，并深入探索其調(diào)控機(jī)制，希望為乳腺癌的臨床治療提供新的思路。

CENPK是著絲粒蛋白家族中的一員，在真核生物的染色體分離過程中扮演重要角色[14]。一些學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)了CENPK在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展。Wang等[15]指出，CENPK基因在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯較癌旁正常組織偏高，過表達(dá)CENPK促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，下調(diào)CENPK基因的表達(dá)且能逆轉(zhuǎn)肝癌的惡性進(jìn)展。本次研究通過查閱TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)比1085例腫瘤組織標(biāo)本和291例正常組織中CENPK基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CENPK在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.05)。此外，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)的CENPK基因的表達(dá)明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A細(xì)胞(P<0.05)，提示CENPK基因在乳腺癌中作為原癌基因存在，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。CCK8實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，過表達(dá)CENPK顯著誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移，這也與Komatsu等人[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。眾所周知，染色體畸變是惡性腫瘤的重要特征，可有效識(shí)別與惡性腫瘤相關(guān)的DNA擴(kuò)增或染色體缺失導(dǎo)致的癌變[17]。CENPK基因的上調(diào)使得染色體有絲分裂和減數(shù)分裂過程異常，過表達(dá)CENPK導(dǎo)致著絲粒異染色質(zhì)沿著色體臂擴(kuò)散，造成微管動(dòng)粒錨定缺陷[18]，最終引起基因組失衡，體外誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞增殖和遷移，加速腫瘤進(jìn)展。

為了進(jìn)一步探究CENPK過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的潛在分子調(diào)控機(jī)制，本次實(shí)驗(yàn)采用Western Blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞內(nèi)AKT/MDM2/TP53信號(hào)通路及其磷酸化的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒的vector組相比，過表達(dá)CENPK激活了AKT和MDM2的磷酸化，抑制TP53的磷酸化。Chibaya等人[19]通過研究發(fā)現(xiàn)，Mdm2絲氨酸殘基183的DNA損傷效應(yīng)激酶AKT磷酸化增加了核MDM2基因的穩(wěn)定性，并下調(diào)了TP53的磷酸化水平，AKT/MDM2/TP53信號(hào)通路通過調(diào)控氧化應(yīng)激應(yīng)答促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和疾病進(jìn)展。作為細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的重要調(diào)控機(jī)制，探究CENPK基因?qū)KT/MDM2/TP53信號(hào)通路的影響可進(jìn)一步證實(shí)該基因在對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖和遷移的促進(jìn)效應(yīng)。本次研究中，過表達(dá)CENPK激活A(yù)KT/MDM2的磷酸化，抑制TP53的磷酸化水平，證實(shí)了CENPK通過調(diào)控AKT/MDM2/TP53信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，介導(dǎo)乳腺癌惡性進(jìn)展，這也與Wang等人[20]實(shí)驗(yàn)結(jié)論相似。

綜上所述，本次研究揭示了CENPK基因在乳腺癌中作為原癌基因存在，在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，過表達(dá)CENPK顯著促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的體外增殖和遷移，相關(guān)的機(jī)制實(shí)驗(yàn)表明，CENPK在乳腺癌中的促癌作用是通過調(diào)控AKT/MDM2/TP53信號(hào)通路的磷酸化水平來發(fā)揮效應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)提示CENPK基因或許是乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)，為后續(xù)的研究和臨床治療提供的新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。然而，本次研究也存在一定的不足之處，比如未經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床病理研究驗(yàn)證CENPK基因在活體中的作用效果是否與體外實(shí)驗(yàn)相似，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步探究。